草菇多酚氧化酶基因的克隆与表达分析

【目的】解析草菇多酚氧化酶基因家族序列信息,明确其特征和表达模式。【方法】通过转录组测序找出含有酪氨酸酶结构域的基因,并根据搜索得到的序列设计引物,以不同发育时期的草菇 v26 菌株,以及草菇蛋形期外菌膜、菌盖、菌柄等不同组织为材料提取 RNA,经反转录为 cDNA,扩增获得草菇多酚氧化酶基因序列。采用在线生物信息学网站预测草菇多酚氧化酶的理化性质。采用 RT-PCR 的方法,检测草菇不同发育时期和不同组织部位多酚氧化酶的表达模式。【结果】获得 4 个草菇多酚氧化酶基因家族的 CDS 序列,依次命名为 VvPPO1、VvPPO2、VvPPO3、VvPPO4,其中 VvPPO1 CDS 全长 1 596 bp、编码 531 个氨基酸,VvPPO2 CDS 全长 2 685 bp、编码 894 个氨基酸,VvPPO3 CDS 全长 1 593 bp、编码 530 个氨基酸,VvPPO4 CDS 全长2 067 bp、编码 688 个氨基酸。生物信息学分析表明,4 个基因编码的蛋白均含有 2 个铜离子结合区,为亲水性蛋白;RT-PCR 结果显示,4 个基因在草菇发育的菌丝期、原基期、蛋形期、成熟期均有表达,VvPPO1、VvPPO3 和VvPPO4 的表达量在子实体时期高于菌丝期,在蛋形期 VvPPO1 和 VvPPO4 在外菌膜的表达量比在菌柄和菌盖中的表达量高。【结论】在草菇中搜索得到 4 个多酚氧化酶基因,均含有 2 个铜离子结合区,4 个基因在各个发育时期均有表达。     

橡胶树乳管细胞GPPS基因的克隆与表达分析

[目的]克隆橡胶树乳管细胞短链异戊烯基合酶(GPPS)基因,分析其表达特性和编码蛋白的相互作用,为解析该类基因在天然橡胶和萜类合成中的作用提供理论参考.[方法]采用逆转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(RACE)从橡胶树乳管细胞胶乳中克隆GPPS基因(HbGPPS1和HbGPPS2),利用生物信息学分析其编码蛋白的特性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HbGPPS1和HbGPPS2在树皮和胶乳中的组织表达特异性、在不同橡胶树品系中的表达模式及其对割胶和外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理的响应模式,并在原核细胞中进行表达分析;通过酵母双杂交技术检测HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的相互作用关系.[结果]从橡胶树乳管细胞乳胶中克隆获得HbGPPS1和HbGPPS2基因,其中HbGPPS1基因编码框长度为1248 bp,编码415个氨基酸,蛋白分子量为45.9 kD,理论等电点为6.77;HbGPPS2基因编码框长度为1239 bp,编码412个氨基酸,蛋白分子量为45.6 kD,理论等电点为6.77.二者的核苷酸序列相似性为89%,且编码蛋白均含有2个典型的异戊烯基转移酶活性结构域DDXXD(D),定位于叶绿体和线粒体.HbGPPS1蛋白自身及其与HbGPPS2蛋白均能形成较弱相互作用的二聚体.qRT-PCR检测结果显示,Hb-GPPS1和HbGPPS2基因在胶乳中的表达量高于树皮,但均以HbGPPS2基因表达量较高,表明二者表达存在组织特异性.经MeJA处理后橡胶树胶乳中HbGPPS1和HbGPPS2基因表达量较对照高,即外源MeJA可促进内源茉莉酸的合成,激活乳管细胞内的茉莉酸信号从而上调HbGPPS1和HbGPPS2基因表达.在5个橡胶树栽培品系中,HbGPPS2基因的表达量均明显高于HbGPPS1基因,且与PR107、热研7-20-59、RRIM600和热研7-33-97干胶含量趋势一致,但二者仅在热研8-79和热研7-33-97的表达模式存在差异.HbGPPS2基因能在大肠杆菌中成功表达.[结论]HbGPPS2基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶和萜类合成的主效基因,而HbGPPS1基因可能是功能冗余基因.HbGPPS2和Hb-GPPS1基因在不同橡胶树品系中的表达模式与各品系干胶含量呈正相关,可用作为干胶含量评估的筛选标记.     

橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

[目的]克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础.[方法]根据已报道的HEV2.1序列(GenBank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定.[结果]用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%.将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA230 1-PHEV2.1-HbHMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功.[结论]将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现PstⅠ突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR.     

橡胶树乳管HbPMP1基因的克隆与表达分析

过氧化物酶体膜蛋白PMP是ABC转运蛋白ABCD亚家族蛋白之一．存在于过氧化物酶体膜上。研究表明．拟南芥中的ABCD亚家族ABC转运蛋白AtABCD1主要通过参与部分物质运输进入过氧化物酶体．其中包括茉莉酸合成的前体OPDA。本研究通过RACE技术克隆了一个ABCD亚家族ABC转运蛋白基因HbPMP1．并进行表达分析。结果表明：HbPMP1全长4011bp．编码1337个氨基酸残基,其表达产物与拟南芥AtABCDl有较高的相似性（氨基酸一致性为78％）：该基因在伤害及外源茉莉酸诱导下呈上调表达．推测其可能参与内源茉莉酸合成相关物质时的运输．     

茶树多酚氧化酶基因的SNP分析

选取有代表性的40个茶树品种(系)为材料,先采用PCR-SSCP-银染检测技术,对供试材料的多酚氧化酶(PPO)基因进行SSCP分析,对PPO基因作初步基因分型;根据分型分析结果,对每一类型选择典型品种的PPO基因作进一步的DNA序列分析,用DNASTAR Program进行单核苷酸多态性(SNP)搜寻.结果表明,茶树PPO基因存在丰富的SNP,其类型包括:转换(AG,CT)、颠换(AT,GC,G→T,A→C)与杂合子(C/T,A/G,G/T,A/T,A/C,G/C).在发现的37个SNPs中,有13个SNPs发生在核酸内切酶酶切位点,有10个错义SNPs位点导致氨基酸的改变.在PPO基因的保守序列区,出现SNP的频率较低.     

烟草多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

多酚氧化酶(PPO)在高等植物中广泛存在,其利用分子氧催化氧化酚类物质为醌,对植物的抗虫和抗病起着一定的作用,同时它介导的酶促反应也是烤制中烟草褐变的主要原因。本文采用RT-PCR,成功地从野生烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆出了PPO c DNA序列。序列分析表明,烟草PPO基因ORF长为1773 bp,编码590个氨基酸,基因登陆号为KC540916,烟草与其他物种PPO的核苷酸序列与氨基酸序列同源性达80%以上,并包含两个高度保守的铜离子结合区域。烟草PPO基因的克隆为烟草的抗性研究和褐化反应的控制研究提供了良好的理论基础。     

草莓多酚氧化酶基因全长的克隆及表达载体构建

【目的】为了提高草莓的果实品质和经济价值。【方法】利用改良CTAB法提取五叶草莓叶片总DNA,反向PCR(IPCR)方法克隆基因。【结果】得到了2条完整的草莓多酚氧化酶基因全长3 591bp和1 809bp,分别编码1 196和602个氨基酸,分别命名为FpPPO1与FpPPO_2,GenBank登录号分别为HM063946和HM063947。FpPPO1和FpPPO_2与其他物种中的多酚氧化酶基因比较,氨基酸相似性分别为57%~77%与74%~99%。最后成功构建了多酚氧化酶基因反义植物表达载体pCP430和正义植物表达载体pCP1809。【结论】克隆得到草莓FpPPO1和FpPPO_2基因全长并构建转基因载体,为研究草莓中多酚氧化酶基因的功能奠定了基础。     

香蕉多酚氧化酶基因编码序列的电子克隆 和生物信息学分析

用电子克隆方法获得香蕉多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）基因编码序列。采用生物信息学方法,对此序列编码的蛋白质从氨基酸组成、理化性质尧疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明：香蕉PPO 基因编码序列全长1602bp,包含1 602 bp开放阅读框（open reading frame, ORF）,含有PPO功能域和酪氨酸酶功能域,在序列组成、高级结构及活性位点等方面,与小麦等其他植物的PPO 基因具有高度的相似性。     

碱蓬多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶,是碱蓬甜菜红素合成的第一关键酶.以盘锦红海滩碱蓬(盐地碱蓬)为研究材料,采用同源克隆法,根据植物中已克隆出的PPO序列进行引物设计,利用RT-PCR和RACE技术,从碱蓬中克隆出的PPO基因cDNA全长为1830bp,编码609个氨基酸.序列分析表明,与其他植物PPO核苷酸序列的相似性为69％～87％,氨基酸的相似性为49％～62％.碱蓬多酚氧化酶基因的成功克隆,为碱蓬甜菜红素的研究和利用打下了坚实的理论基础.     

橡胶树乳管细胞中活性氧的产生与清除

论述了橡胶树乳管细胞内活性氧的产生系统、活性氧在乳管细胞内所起负面作用及消除活性氧毒害的酶促及非酶促清除系统。     

巴西橡胶树乳管分化的研究进展

综述了巴西橡胶树乳管分化的形态学描述、实验形态学研究和分子生物学3个阶段的研究进展,并对其发展方向进行了分析。     

橡胶树乳管发育与产胶量关系研究

 橡胶树无性系乳管列数、密度(个)和口径3个要素是衡量无性系产胶量的重要依据.乳管3个要素或2个要素的值比另一无性系的值高者,产胶量高,反之则低.高产无性系的乳胶管列数增幅大,低产无性系增幅小.无性系各分枝间乳管3要素的值差异小,各分枝均可取枝条嫁接繁殖.高产实生树各分枝之间,乳管3要素的值差异大,应选取乳管3要素的值高的分枝嫁接繁殖,才能获得高产的个体群.     

植物多酚氧化酶的研究进展

植物多酚氧化酶是一类含铜的金属蛋白,催化单元酚和二元酚等多元酚到联苯酚以及联苯酚到醌的脱氢反应。植物多酚氧化酶被认为是许多果实等农产品有害褐变的主要原因,同时被认为与病原体或虫害相互作用有关,只是目前仍缺少直接的证据。就植物多酚氧化酶的功能、发生和基因及其表达等方面进行了简要的综述了探讨。     

魔芋多酚氧化酶基因保守区的克隆及序列分析

根据植物多酚氧化酶基因保守区域设计简并引物,采用同源克隆的方法,从花魔芋幼叶中首次克隆得到魔 芋PPO 基因的部分gDNA和cDNA片段.该gDNA和cDNA片段长度均为762bp,编码254个氨基酸残基.生物 信息学分析表明具有酪氨酸酶家族的特征,具有保守的CuA和CuB结合区.系统进化树表明:花魔芋PPO 蛋白与 禾本科植物(大麦、小麦、玉米)最先聚为一类,亲缘关系最近.     

巴西橡胶树乙醇酸氧化酶HbGOX1基因的鉴定与表达分析

光呼吸途径是植物中重要的反应途径,它通过消耗光合作用产物影响作物的产量。乙醇酸氧化酶是该途径的关键调控酶,在橡胶树中尚未见研究报道。本研究分离和鉴定橡胶树HbGOX1基因的全长cDNA序列,对其编码的蛋白质进行生物信息学分析,并通过qPCR技术进一步研究HbGOX1基因在低温胁迫下的表达情况。结果发现,该基因受低温胁迫负调控。此结果为进一步揭示橡胶树光呼吸途径在橡胶合成中的作用奠定了基础。     

长春花感染黄龙病菌多酚氧化酶基因的表达及活性分析

【目的】分析长春花Catharanthus roseus受黄龙病菌Candidatus Liberibacter asiaticus侵染后多酚氧化酶(PPO)基因的表达及活性变化。【方法】根据不同作物多酚氧化酶基因PPO序列的相似性,筛选出长春花多酚氧化酶基因Pw PPO引物,PCR扩增得Pw PPO基因片段,运用qRT-PCR和生理生化方法分析长春花嫁接黄龙病芽后,不同时间长春花叶、主茎和根中Pw PPO基因的表达量和酶活性变化。【结果】长春花受黄龙病菌侵染后,叶、主茎和根中Pw PPO基因的表达分别在嫁接后30、35和40 d上调表达4.23、12.64和33.80倍,不同组织中Pw PPO基因上调表达的时间和幅度不同。染病长春花的叶、主茎和根中PPO活性分别在嫁接后30、35和45 d为对照的2.87、2.10和1.89倍。【结论】Pw PPO基因表达量与PPO活性成正比,与长春花抵抗黄龙病菌侵染的能力密切相关。     

橡胶树乳管特异性启动子连接HbHMGR1基因的易碎胚性愈伤组织转化

[目的]以3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1基因(HbHMGR1)乳管表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,获得抗性转基因材料,为研究HbHMGR1基因的乳管特异性表达及提高橡胶产量打下基础.[方法]用根癌农杆菌EHA105介导表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树品种热研8-79花药易碎胚性愈伤组织,经卡那霉素筛选数月后,对抗性愈伤组织进行GUS染色和分子检测.[结果]经过对根癌农杆菌侵染的易碎愈伤组织进行4~6个月筛选,得到5个GUS检测呈阳性的抗性愈伤组织系;取其中的2号和11号抗性愈伤组织系进行PCR鉴定,均能扩增出与阳性对照相同的特异片段,uidA、NPTⅡ和PHEV2.1-HbHMGR1序列的目的片段大小分别为829、797和3592bp.2号和11号抗性愈伤组织系经反向PCR鉴定,发现2号抗性愈伤组织系未扩增出目的条带,而11号抗性愈伤组织系扩增获得一条约2000 bp的条带,包含T-DNA序列和一段未知的DNA序列,其中未知DNA序列是橡胶树品种热研8-79基因组的一段连续序列.[结论]将植物表达载体的T-DNA整合到抗性愈伤组织系基因组DNA中,可获得一个含35S-NPTⅡ-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的转基因愈伤组织系.     

荸荠多酚氧化酶基因的克隆及其在鲜切荸荠贮藏过程中的表达分析

利用RACE技术首次从荸荠中克隆得到PPO基因全长cDNA序列,并分析其在鲜切荸荠贮藏过程中的表达变化。克隆得到的荸荠PPO基因cDNA序列全长为2 006 bp,开放阅读框长度为1 734 bp,编码577个氨基酸,命名为CwPPO(登录号:MG702489)。预测分析表明,CwPPO编码蛋白质的分子量为64.86 ku,分子式为C_(2891)H_(4417)N_(795)O_(873)S_(18),理论等电点为6.50,属亲水性蛋白。CwPPO蛋白可能定位于线粒体基质空间,具有3个典型的保守结构域和2个铜离子结合域。此外,预测发现CwPPO有20个丝氨酸磷酸化位点、7个苏氨酸磷酸化位点及6个酪氨酸磷酸化位点,其二级结构以不规则卷曲为主。系统发育分析显示,CwPPO蛋白与菠萝、油棕有较近的亲缘关系。荧光定量分析发现,CwPPO在鲜切荸荠中的初始表达水平较低,但在贮藏后期表达量快速提高。     

烟草多酚氧化酶生物信息学分析

为对烟草多酚氧化酶进行生物信息学分析,利用ProtScale、PhyML和Meme工具读取烟草多酚氧化酶,进行疏水性、进化树和保守基序分析。结果表明,烟草多酚氧化酶各成员均为亲水性氨基酸;多酚氧化酶成员的进化树被划分为三类,其中烟草和番茄聚为一类,第二类中的成员最多;NtPPO1、NtPPO2和NtPPO3均含有相同的保守基序,NtPPO1和NtPPO2分布位置较为相似,而NtPPO3与其存在一定的差异。