基于RNAi技术转移脂肪酸延长酶基因fae1 及转基因油菜的获得

通过构建RNAi载体抑制油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）表达，获得了油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实，成功构建完成油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）反向重复结构RNAi载体；通过农杆菌介导的油菜转化，经RCR及印染检测，获29个油菜转基因再生株系。     

以油菜脂肪酸延长酶基因fae1为靶标RNAi载体的构建

通过基因工程手段抑制脂肪酸延长酶基因fae1的表达,以阻止芥酸合成,培育不受高芥酸窜粉影响的低芥酸品种.利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物和多聚酶链式反应(PCR)从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的12个不同品种中扩增出长1007bp的fae1基因片段,通过对fae1基因片段DNA序列的测定和序列比较,找到长度为428bp高度保守区作为RNA干涉(RNAi)的靶标区.根据RNA干涉(RNAi)双向表达载体设计原则,将428bp fae1基因片段以正反两个方向插入双向表达载体pMCG161中,两个片段用一个wax基因的内含子连接,植物筛选标记基因采用bar基因,从而构建以油菜fae1基因为靶标的RNAi载体.     

油菜PEPase基因的克隆及其对应RNAi载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中双4号中扩增出PEPase基因cDNA片段,与已发表的PEPase基因(登录号为D13987)序列同源性为98%.根据RNA 干扰(RNAi)目标序列的选取原则选取两段长度约为400bp的DNA序列,分别克隆到RNAi载体pHBM1301中,构建了油菜中对应于PEPase基因的RNAi载体pHBM1301-PEP1和pHBM1301-PEP2.     

草莓NCED基因正反义表达载体和RNAi载体的构建

根据草莓（Fragaria ananassa Duch）NCED基因序列（GenBank： HQ399498），克隆NCED基因开放阅读框，将该片段插入植物表达载体pBI 121的CaMV 35S 启动子和NOS 终止子之间，构建了正义表达载体pBI 121NCED。克隆NCED基因正义、反义片段和作为内含子的gusA基因片段，以植物表达载体pBI 121为基础，以pCAMBIA2301作为中间载体，通过多次酶切和连接，成功构建了草莓NCED基因RNAi表达载体pBI 121NCEDRNAi和反义表达载体pBI 121NCEDF。经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，成功将pBI 121NCED、pBI 121NCEDF和pBI 121NCEDRNA 3个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中。研究结果为进一步研究草莓NCED基因的功能奠定了基础。     

RNAi干扰油菜Δ12-脂肪酸脱饱和酶基因的表达效果

为进一步研究RNAi介导的Δ12-脂肪酸脱饱和酶（FAD2）干扰基因对油菜内源FAD2基因表达的影响,以油菜肌动蛋白(β-Actin)基因为内参照基因,提取转基因油菜幼嫩种子总RNA,通过半定量RT-PCR检测内源FAD2基因的相对表达量。结果表明,T1,T3代转基因种子中FAD2基因的相对表达量与对照相比明显降低。对T3代种子的油酸含量的分析表明：转基因油菜种子中油酸的含量比野生型增加了13.90到32.20个百分点,直接说明RNAi干扰体下调了FAD2基因的表达。因此,种子内源表达的FAD2基因被RNAi干扰体有效沉默,并且产生了能够稳定遗传两代的表型变化。     

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的转化

植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白参与了逆境应答,为研究甘蔗A20/AN1型锌指蛋白基因ShSAP1的功能及在甘蔗抗逆育种方面的价值,本研究通过构建ShSAP1基因的RNAi载体并进行甘蔗的遗传转化,以期通过反向遗传学进行ShSAP1的功能分析。将ShSAP1锌指编码区片段分别以正向和反向插入到中间载体pTCK303内含子的两侧,构建中间载体pTCK-iShSAP1,而后把干扰片段连入pCAMBIA-GUS中,获得RNAi表达载体pCAMBIA-iShSAP1,将该载体转导根癌农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织,并对部分转化幼苗进行了初步的PCR鉴定。经过限制性内切酶分析和测序验证,RNAi载体pCAMBIA-iShSAP1构建成功;转化幼苗经PPT抗性筛选后,获得了58株抗性植株,对抗性幼苗进行了Bar基因的PCR检测,得到6株PCR阳性植株。本研究完成了ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的遗传转化,为ShSAP1的功能研究打下了一定的基础。     

RNAi研究及在植物中的应用

RNAi（RNA interference）技术可通过降解靶基因的mRNA进行基因干涉，是研究多种生物基因功能的有效手段。概述了RNAi的作用机制、特点及其植物RNAi载体的构建。同时介绍了RNAi在植物的基因功能、抗病性、雄性不育等方面的应用。     

香蕉Maasr1基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定

以香蕉Maasr1基因为目的基因,载体pBS为中间载体,pBBB、pBI121为表达载体,分别构建含有Maasr1基因的RNAi植物表达载体DBBB-S-I-A和含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBl121-S,并通过农杆菌介导的方式对构建的该RNAi载体沉默效果进行鉴定.结果表明:(1)利用中间载体pBS和植物表达载体pBBB成功构建了香蕉Maasr1基因的RNAi植物表达载体pBBB-S-I-A;(2)利用载体pBI121成功构建了1个含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBI121-S:(3)构建的RNAi载体pBBB-S-I-A可以抑制Maasr1基因的表达,具有较好的沉默效果.     

番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建

为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白（CP）、辅助成分－蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。     

大豆脂肪酸脱氢酶GmFAD3C-1基因的克隆及功能分析

研究通过对大豆脂肪酸脱氢酶GmFAD3家族中4个关键酶基因序列进行比对,与对照JN18相比,大豆低亚麻酸突变体MT72中GmFAD3C-1基因在起始密码子后+966bp处存在一个碱基位点的缺失（G→?）,产生移码突变,导致氨基酸序列上产生较大变化（该突变基因命名为gmfad3c-1）。构建GmFAD3C-1基因超表达及CRISPR/Cas9编辑载体,利用花粉管通道法获得T₂转化植株。脂肪酸脱氢酶酶活测定结果显示,超表达植株T₂籽粒中,酶活与对照相比上升47.62%~78.85%,编辑载体T₂籽粒中,酶活与对照相比下降25.67%~47.11%。脂肪酸相对含量测定的结果进一步表明,GmFAD3C-1基因的表达与植株亚麻酸含量密切相关。     

根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建

针对根结线虫16D10基因和花生△12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的核酸序列设计了两条含有GUS内含子的RNA干扰结构序列.以pBS-T质粒为中间载体,将这段序列连接进植物转化载体pRI 101-AN中,获得针对两个基因的RNAi载体.经SalI和KpnI双酶切验证,目的序列已准确插入目标载体.此载体可用以培育抗根结线...     

亚麻木质素合成相关基因COMTRNAi表达载体构建及转化

以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。     

基因工程技术与油菜育种

从油菜脂肪酸代谢的基因工程改造，抗虫、抗病、抗（耐）除草剂转基因油菜及基因工程杂交油菜品种等方面，综述油菜基因工程育种取得的进展，提出在今后的油菜育种中，基因工程技术将是一种极为重要的手段。     

水稻OsMAPK17-1基因的分离及转基因研究

OsMAPK17-1作为一种MAP激酶，受多种生物和非生物胁迫的诱导，且对病原菌的侵染有一定的防卫作用。为研究水稻OsMAPK17-1基因的功能，通过RT-PCR方法分离OsMAPK17-1基因全长cDNA，分别构建过表达与RNAi植物表达载体，采用农杆菌介导法以粳稻日本晴为受体进行遗传转化，PCR检测具有潮霉素抗性基因的转基因水稻植株，结果表明：OsMAPK17-1基因及RNAi片段均已整合到水稻基因组中。利用PCR和RT-PCR的方法对转基因后代进行筛选，获得过表达和RNAi转基因纯系各1个，模拟干旱处理结果表明，RNAi株系在干旱处理下比对照更有利于根的生长，这些结果为进一步研究OsMAPK17-1基因的功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜-核盘菌酵母双杂交cDNA文库构建及BnJar1互作蛋白筛选

油菜与核盘菌相互作用的过程中，JA（茉莉酸）合成相关基因表达量升高，但是JA信号传递却受到了抑制，推测核盘菌分泌的效应蛋白可能直接或间接作用于JAR1蛋白，使其活性降低，从而抑制依赖JA途径的油菜防御系统。前期通过转录组测序获得了差异表达基因BnJar1全长序列，为进一步揭示BnJar1基因参与油菜-核盘菌相互作用过程的机理，本研究对BnJAR1蛋白进行生物信息学分析和预测，构建了核盘菌-油菜互作表达基因酵母文库，并以BnJar1作为诱饵蛋白对文库进行酵母双杂交筛选，获得了5个来自油菜的互作蛋白：丙二烯氧化物环化酶2(BnAOC2)、COP9信号复合物（BnCOP9）、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶（BnDcoH）、腈水解酶2(BnNIT2)和茎特异性蛋白（BnTSJT1）;2个来自核盘菌的互作蛋白：MFS结构域蛋白（SsMFS）和Rho3 GTP酶（SsRho3）。相关结果为研究油菜-核盘菌的相互作用，挖掘致病或抗病相关基因，进一步解析其机理奠定了基础。     

β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体抑制大豆抗原蛋白的表达

为幼龄动物提供优质的大豆饲料,同时有效抑制α'亚基和β亚基基因表达量,根据dsRNAi原理,以α'亚基基因RNAi重组植物表达载体p CAMBIA3301-PFNZ-BADH为基础,构建以BADH安全标记为筛选标记的α'亚基和β亚基基因双价RNAi植物表达载体。用根癌农杆菌介导法转化大豆子叶节,并对再生植株进行分子生物学检测。结果表明:成功构建β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体,并获得大豆转基因植株。T1转基因大豆植株经PCR检测得到11株阳性转化株,经Southern杂交检测证明构建的双价植物表达载体已经以1~2个拷贝整合到大豆基因组中,实时荧光定量PCR检测表明β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因的表达被明显抑制。     

高羊茅FaSGR基因RNAi载体构建

本实验利用Gateway技术构建了Ubiquitin启动子驱动的高羊茅Fa SGR基因的RNAi载体p ANDA-B-870,该载体具有潮霉素抗性,适合于单子叶植物遗传转化。通过电击法将p ANDA-B-870载体转入到根癌农杆菌EHA105感受态细胞中,验证转化成功。Fa SGR基因RNAi载体的构建为进一步探讨Fa SGR基因功能及SGR滞绿基因在高羊茅遗传改良中的应用提供了技术支持。     

甘蓝型油菜GPAT6基因启动子的克隆与表达载体构建

通过同源PCR克隆的方法,首次从甘蓝型油菜中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶6（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase6,GPAT6）基因长1110bp的启动子,并将其成功构建到植物表达载体pBI121上.重组载体可用于转化拟南芥,探究甘蓝型油菜GPAT6基因的组织表达特征.     

甘蓝型油菜脂肪酸碳链延长酶BnaA.FAE1与BnaC.FAE1的底物特异性分析

为提供信息改良油料种子脂肪酸,研究脂肪酸碳链延长酶1（FAE1）的底物特异性,将甘蓝型油菜A、C基因组的BnaA.FAE1和BnaC.FAE1分别在亚麻荠种子中表达。其转基因种子中山嵛酸与芥酸含量的比值（C22:0/C22:1）分别为0.18和0.88,表明BnaA.FAE1对单不饱和脂肪酸亲和力较高,而BnaC.FAE1则对饱和脂肪酸亲和力较高,这种差异在各转基因世代表现稳定。通过分析T3转基因家系种子中酰基辅酶A（Acyl-CoAs）的组成,进一步证明了上述结论。但是在拟南芥中分别异源表达上述基因,并没有观察到类似的底物特异性差异。在甘蓝型油菜祖先种,白菜型油菜和甘蓝种子中调查其C22:0/C22:1比值,同样未发现其FAE1底物特异性存在差异。综上认为BnaA.FAE1和BnaC.FAE1在亚麻荠中存在底物特异性。