转基因大豆中外源基因的二重PCR检测

用CTAB法提取转基因大豆(Roundup Ready品系)的总DNA.根据行业标准SN/T 1195-2003,合成用于扩增花椰菜花叶病毒(Cauliflowerm osaic viru,s CaMV)35S启动子的引物S1和S2、根癌农杆菌(Agrobacterium tum efaciens)CP4菌株EPSPS基因的引物Ea、ER和Eb.应用这5条(2组)引物对转基因大豆进行二重PCR检测时,扩增得到2个新片段,分别与片段S1ER、S1Eb大小一致.将片段S1ER、S1Eb进行克隆并测序,序列已在GenBank上登录,接受号分别为AY592954和AY596948.序列分析结果表明,片段S1ER含有CaMV 35S启动子和矮牵牛叶绿体转运肽序列(CTP)的部分序列,片段S1Eb含有CaMV 35S启动子部分序列、CTP和CP4 EPSPS基因的部分序列,原用于扩增CP4 EPSPS基因的引物中,仅引物Eb位于CP4 EPSPS基因中.重新合成扩增CP4 EPSPS基因的引物E1和E2,建立的二重PCR方法不仅适合于转基因RoundupReady大豆,还适合于其它植物中的CaMV 35S启动子和CP4 EPSPS基因的同时检测.     

ISSR标记技术及其在果树遗传育种中的应用

简单重复序列间扩增(ISSR)是在简单重复序列(SSR)基础上发展起来的一种新技术.该技术以锚定的微卫星DNA为引物,对与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片断进行PCR扩增.ISSR标记具有较长的引物序列,退火温度高.表现出较好的稳定性,且结合位点丰富,可以检测到基因组中多个位点的差异,能够揭示出比限制性片段长度多态性(RFLP)、随机引物扩增多态DNA(RAPD)、SSR更多的多态性信息.对ISSR标记技术的原理、特点及其在果树种质鉴定、遗传多样性、居群遗传结构、进化与亲缘关系分析以及分子辅助育种等研究方面的应用进行了综述.     

白及种质资源遗传多样性分析

【目的】采用简单重复序列间扩增(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)等2种标记技术分析不同种源白及Bletilla striata样本的遗传多样性水平和遗传关系,为白及种质的鉴定、分类、保护和开发提供理论依据。【方法】从100个ISSR引物和238对SRAP引物组合中筛选出多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,用Popgene 32.0计算来自浙江、云南、贵州和四川等省32个不同种源白及的遗传多样性参数和遗传距离,用NTSYS-pc 2.10e进行聚类分析。【结果】从100个ISSR引物中筛选出11个多态性较好的引物,共扩增出188个条带,平均每个引物扩增出17.09个条带,其中多态性位点174个,占总扩增片段的92.20%;从238对SRAP引物组合中筛选出11对多态性较好的引物组合,共扩增出216个条带,平均每个引物扩增出19.64个条带,其中多态性位点202个,占总扩增片段的93.52%。综合ISSR和SRAP的标记结果发现：四川白及种源的遗传多样性水平最高,贵州最低;非加权组平均法(UPGMA聚类)和主坐标分析(PCoA分析)结果显示：聚...     

棉花耐盐相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记筛选

利用相关序列扩增多态性(SRAP)和群体分离分析法(BSA)对棉花耐盐材料×敏盐材料组合的F2群体及26个耐、敏品种(系)进行分析和鉴定,筛选与棉花耐盐相关的分子标记。在88对正反引物组合中,筛选出在2个亲本间具有多态性的引物6对,经F2群体分析,发现1对引物能够在耐盐单株中扩增出350 bp的特异片段,而在敏盐单株中没有。品种鉴定显示,耐盐材料均能扩增出该片段,而敏盐材料没有该片段扩增。推测该片段是与棉花耐盐性紧密连锁的分子标记。     

利用SCAR-PCR检测杂交油菜"蜀杂9号"的杂种纯度

用两个分别能在“蜀杂9号”父、母本之间稳定产生多态性的随机引物S18和S31,对父、母本DNA样品进行RAPD扩增,将得到的特异标记片段S18750和S31550进行回收、克隆和测序。根据测序结果设计序列特异性扩增(SCAR)引物SZ9SP1和SZ9SP2,将“蜀杂9号”的亲本RAPD标记转化为序列特异的SCAR标记。当用两对引物分别扩增杂种F1代单株总DNA时,能分别获得父、母本特异序列扩增带,表明获得的SCAR标记能可靠地用于“蜀杂9号”杂种纯度的检测。     

利用磁珠富集法开发花榈木微卫星引物

将花榈木(Ormosia henryiPrain)基因组DNA用MseⅠ酶切后,连接相应的接头,PCR扩增后回收500~1000bp片段,与用生物素标记的微卫星探针(GA)12,(AAG)8杂交后,运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。获得的序列经PCR扩增,连接载体pMD19-T,构建富含微卫星序列的小片段插入文库;用PCR法筛选文库,获得78个阳性克隆,经测序分析得到24个微卫星序列,成功设计出9对引物。     

甘蓝型油菜黄籽基因RAPD标记的初步研究

采用RAPD技术,以甘蓝型油菜近等基因系03 L 1(黑籽)和03 L 2(黄籽)为材料,对200个10 nt的RAPD引物进行了筛选.有18个引物能在近等基因系间扩增出差异片段,其中6个引物在重复实验中表现出很好的重复性.这6个引物扩增出的6个特异片段可能是甘蓝型油菜黄籽基因的RAPD标记.     

20株草菇遗传多样性的分析

旨在借助分子标记手段对草菇菌株进行鉴别。利用17条扩增条带清晰、稳定的随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,简称RAPD)、简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat,简称ISSR)引物对20株草菇菌株基因组DNA进行PCR扩增,分析草菇菌株的遗传差异。结果表明,17条引物共扩增出123条清晰的DNA片段,其大小为250～2 000 bp,其中多态性片段92条,平均多态性位点占比为74.80%。DNA电泳结果表明,所有供试菌株间的DNA指纹均存在差异。     

内蒙古自治区马铃薯常见品种差异性分析

本研究利用单序列重复(Simple Sequence Repeat,SSR)分子标记技术对内蒙古36份马铃薯品种进行基因组扩增分析.结果表明,供试的11对引物共扩增出70条条带,其中多态性条带66条,多态性百分率94.2％,平均扩增片段数和扩增多态性均呈现较好的效果.聚类分析结果表明,按不同聚类方法可分别将36份材料聚...     

一个花生新SSR标记的开发

本研究利用SCoT12引物对8个不同花生品种扩增产物中的一个长度多态性片段SCoT12-800进行克隆和测序分析,该序列登录号为KM200036。结果表明,该片段多态性是由于其含有一段TC简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR),根据该片段序列,利用Primer 5.0软件设计出一对适合SSR分子标记检测的引物,命名为SCoT12-SSR,该引物的扩增产物大小为164~178 bp,在花生栽培种中可检测到5个等位变异,可用于花生的遗传多样性、品种鉴定、基因定位和遗传图谱的构建等研究。     

AFLP and SCAR Markers Associated with Peel Color in Eggplant （Solanum melongena）

Peel color is an important breeding objective for eggplant. Dark purple and purplish red are the most common colors in commercial eggplant cultivars. A co-dominant amplified fragment length polymorphism （AFLP） marker which was associated with the peel color （each in coupling phase to dark purple and purplish red） was found in studying the genetic diversity in 58 eggplant accessions （contained cultivars and wild relatives）. The maker bands were sequenced and converted to SCAR marker, this polymorphism in sequence was from an inserted/deleted （indels） mutation. And DNA from 136 eggplant materials （inbred lines, F1, and wild relatives） were amplified with the designed SCAR primers as template, high correlation between the SCAR marker and peel color （dark purple and purplish red） was found. Then, bulked line analysis （BLA） combined with AFLP was further used to identify polymorphic fragments, and another six AFLP markers were tested and verified to be associated with peel color, which demonstrated that BLA was an useful method for identifying molecular markers of interested traits. In conclusion, these markers will facilitate the MAS （maker-assisted selection） of eggplant breeding for peel color.     

利用RAPD—BSA分子标记技术筛选金针菇色泽基因研究

色泽是金针菇的重要性状之一,受一对等位基因的控制。以FL19(黄色)、8801(白色)及其后代(F1代、F2代)菌株和相应单核菌株为材料,采用分离群体分组分析(BulkedSegregantAnalysis,BSA)方法,对金针菇基因组DNA进行RAPD分析,通过对200个引物的筛选,获得了一个与白色性状基因紧密连锁的RAPD标记S3751800,并在亲本及其后代菌株进行了验证,具有较好的重复性和稳定性。可用于白色金针菇新品种的辅助选育。     

生防真菌球毛壳ND35的RAPD特异序列的标记转换

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对包括球毛壳ND35在内的20个真菌分离物进行分析,筛选出球毛壳ND35的RAPD扩增特异性DNA片段,经pEASY—T3载体克隆和测序、Seqman整合后,用Primer5．0软件设计了球毛壳ND35的特异引物对CgND35—1：GTTGCCAGCCCGAGGGGAAG,CgND35—2：G111ACCAGCCATGCCTTGAAG,经优化PCR条件,成功获得球毛壳ND35的SCAR标记,该标记片段长度为329bp。用CgND35—1／CgND35—2引物对进行了SCAR标记特异性和灵敏度检测,表明该特异引物可用于球毛壳ND35的快速检测。     

与苦丁茶炭疽病抗性基因连锁的RAPD标记

为了研发出与苦丁茶炭疽病抗性基因紧密连锁的RAPD-SCAR特异标记,本研究中首先利用92条RAPD随机引物对苦丁茶冬青中已知对炭疽病高抗或高感的不同种质材料进行RAPD分析,并从中寻找到4个与苦丁茶炭疽病抗性基因紧密连锁的RAPD特异标记特异性片段S69-300,S227-300,S227-2000和S247-400。后续的研究可对这些RAPD特异片段进行回收,扩增和测序,并将测序结果作为开发与苦丁茶炭疽病抗性基因紧密连锁的SCAR标记的基础。     

稻蝗属特异性SCAR分子标记的鉴定

【目的】研究稻蝗属特异性DNA分子标记,为稻蝗属物种的分类鉴定提供快速有效的分子检测方法。【方法】基于稻蝗属物种及其近缘属种的大量RAPD-PCR结果,筛选出稻蝗属物种特异性的RAPD条带,对该特异RAPD条带进行克隆、测序。基于所测序列设计特异引物,以稻蝗属不同物种和蝗总科其它物种基因组DNA为模板进行PCR扩增。【结果】随机引物S823可在稻蝗属不同物种扩增出约650bp的RAPD条带,经对该条带的克隆、测序,发现在3个受试的稻蝗属物种中序列同源度达92.3%—96.6%,序列G+C含量大于15%,并富含大量的A、T重复区;基于已知序列设计的特异引物对稻蝗属7个物种可以扩增出目的条带(550bp),而对赤胫伪稻蝗及蝗总科其它物种均无扩增条带。【结论】鉴定了稻蝗属特异的RAPD条带,基于该条带序列设计的特异引物可用于稻蝗属物种的快速分子鉴定。     

利用AFLP方法筛选中华绒螯蟹性别相关标记

利用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术筛选中华绒螯蟹性别相关标记,共使用192对引物组合检测中华绒螯蟹雌、雄和雌雄混合3个基因组池的多态性,共扩增出5 376条多态性条带,平均每对引物组合扩增出28条多态性条带,获得88条雌雄差异条带。利用雌雄各10个个体再次进行AFLP验证,共62条差异条带具有性别差异,包括两种情况:(1)有49条条带在雌性的4～6个个体中存在,在雄性全部个体中缺失;(2)有13条条带在雄性4～6个个体中存在,在所有的雌性个体中缺失;其余的26条没有性别差异性。差异条带经回收、克隆、测序,结果发现有些条带包含多个序列,共得到77条DNA序列,其中31条序列与鸟类、两栖类和哺乳类等脊椎动物性染色体DNA部分片段具有同源性,相似区间在22～212 bp不等,其中6条DNA序列与命中序列之间具有生物学相关性。设计特异性的引物在基因组中检测,没有获得性别特异SCAR标记。     

Development of a stable SCAR marker for rapid identification of Ganoderma lucidum Hunong 5 cultivar using DNA pooling method and inter-simple sequence repeat markers

The cultivar Ganoderma lucidum Hunong 5 was obtained using cross-breeding. Hunong 5 has high commercial value due to its high polysaccharide and triterpene content. This is the first report of using a DNA pooling method to develop a stable sequence characterized amplified region (SCAR) marker for rapid identification of the G. lucidum Hunong 5 cultivar. The SCAR marker was developed by first generating and sequencing a distinctive inter simple sequence repeat (ISSR) fragment (882 bp) from G. lucidum Hunong 5 cultivar. A stable SCAR primer pair GLH5F/GLH5R were obtained to identify the cultivar and the SCAR marker is a DNA fragment of 773 bp.     

偃麦草E染色体组特异RAPD和SCAR标记的建立

用100条10碱基随机引物，以普通小麦中国春，中间偃麦草为材料进行RAPD分析，筛选到一个偃麦草染色体组特异引物OPF03，并从中间偃麦草中克隆了该引物的特异DNA片段OPF031291。将该片断与比萨偃麦草中的OPF031296（GenBank序号U43516）比较，同源性为88％。根据OPF031291的序列，设计了2对SCAR引物，利用OPF03和引物P3，P4对普通小麦，普通小麦－中间偃麦草的部分双二倍体，长穗偃麦草，中间偃麦草，小麦－二倍体长穗偃麦草代换系，附加系共6类材料进行了RAPD和SCAR分析，发现RAP标记OPR031291没有出现在含E^e染色体组的材料中，而标记SCAR982则出现于所有含E染色体组的材料中。说明，根据E^b染色体组特异RAPD标记转化的SCAR标记，可以同时检测小麦背景下的E^e染色体。     

小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记

 【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45 SCAR（sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域）标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本,利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增,对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序,并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF,对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增,验证该标记与Lr45的连锁关系,Mapmaker 3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带,片段大小为1 272 bp（命名为Ypsc20H1272）,而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析,遗传距离为8.2 cM,该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。