不同获能方法对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响

为探讨不同获能方法对塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响,冻融塔里木马鹿精子随机分为4组,用钙离子载体、肝素、咖啡因和 Percool 离心4种方法进行精子获能的诱导,利用金霉素（CTC）染色法评价精子获能状态,采用 SDS-PAGE 分离精子膜蛋白,进行 Western blotting 免疫印迹分析,检测酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平.结果显示,冻融精子经4种精子获能方法处理后,肝素诱发的精子获能率显著高于钙离子载体组和 Percool 组（P ＜0．05）.钙离子载体组、肝素组和咖啡因组精子蛋白酪氨酸磷酸化水平高于 Percool 组和对照组.另外,冻融精子随着上游处理及肝素诱导获能的进行,检测到分子量分别为14,25~30,40,47,55 ku 的酪氨酸磷酸化蛋白,这些蛋白的酪氨酸磷酸化水平在获能60~120 min 期间相对较高,而且此时精子获能率及超激活运动精子比例也显著提高（P ＜0．05）.结果提示,肝素可以较好的诱导马鹿精子获能,马鹿精子获能与蛋白酪氨酸磷酸化相关.     

猪精子获能期间蛋白质磷酸化时间依赖性的上调

通过获能猪精子酪氨酸磷酸化蛋白分离和表达,来确定精子获能的最佳状态.将猪精子悬浮于改良的Tris缓冲液(mTBM)获能培养基中,在体积分数为5% CO2孵箱37 ℃培养,以考马斯亮蓝染液染色的方法来评价精子获能状态, 经过SDS-PAGE分离后,进行Western免疫印迹分析,检测获能猪精子间酪氨酸磷酸化蛋白的分布.有27,47 ku的2种蛋白发生酪氨酸磷酸化,其中27 ku的蛋白酪氨酸磷酸化水平自精子体外培养后呈递增趋势,而 47 ku的蛋白酪氨酸磷酸化水平在精子培养1.5 h时最高,后呈递减趋势,1.5 h时获能状态最佳.     

冷应激对猪精子活力的影响

我国北方建立公猪采精站后,生产上最大的隐患就是精液冷应激对精液质量产生负面影响,虽然冷应激的精液经过1h左右的缓冲是可以恢复原有活力的,但其生命力已大大减弱。对生产上使用冷应激精液配种的数据进行统计、对比、分析后发现,冷应激对精液生产的危害非常大。     

pH、盐度及K+、Ca2+和葡萄糖对萨罗罗非鱼精子活力的影响

[目的]确定萨罗罗非鱼精子活力最高时各因子的最佳参数,进一步提高尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂的受精率.[方法]利用显微镜观察对比不同梯度pH、盐度、离子及葡萄糖溶液中萨罗罗非鱼精子的活力状况,考察指标包括精子快速运动时间、寿命及激活率.[结果]pH 7.5～8.0时,萨罗罗非鱼精子激活率最高,达90％;在pH 7.5的条件下,精子快速运动时间和寿命最长,为66.33±2.25和933.17±25.79 s.在25‰～32‰的盐度范围内,萨罗罗非鱼精子活力较强,其中以30‰的精子活力最高,快速运动时间和寿命分别为63.50±2.35和402.50±7.31 s,激活率达90％.随K+浓度的增加,萨罗罗非鱼精子的快速运动时间、寿命及激活率均呈先升高后降低的变化趋势,其中以75mmol/L的精子活力最高,精子寿命为500.33±8.69 s,激活率为90％.Ca2+对萨罗罗非鱼精子活力有明显抑制作用,其浓度为37.8 mmol/L时精子快速运动时间和寿命最长,分别为38.50±2.43和117.50±3.21 s,精子激活率为80％;而后随Ca2+浓度的增加,精子开始出现聚集现象,活力明显下降,Ca2+浓度增至151.2mmol/L时,精子已完全失活.相对于K+和Ca2+,葡萄糖可适当延长萨罗罗非鱼精子寿命,其浓度为150mmol/L时,精子寿命最长,为281.00±5.90 s,激活率达90％.[结论]针对尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂人工繁殖中受精率低的问题,生产上除了选择优质尼罗罗非鱼卵细胞、优化孵化环境及人工繁殖技术外,还可通过适宜游动介质参数(pH 7.5～8.0、盐度30‰～32‰、75～100mmol/LK+、37.8 mmol/L Ca2+、100～125mmol/L葡萄糖)激活萨罗罗非鱼精子活力,进而提高其杂交受精率.     

猪精液稀释液中不同水质对精子活力的影响

通过对猪精液稀释液采用不同水质的试验研究，结果表明：无污染的高山矿泉水和质量好的蒸馏水作稀释用水的精子存活时间最长，而用天然河水作稀释用水的精子存活时间最短。     

重金属铬对体外培养猪精子活力及蛋白磷酸化水平的影响

为探究铬元素在猪精子体外获能培养过程中,对猪精子活力、蛋白磷酸化信号通路的影响,研究采取八头杜洛克猪新鲜精液,分别在体外获能培养液中添加不同浓度的6价铬离子(0、0.1、0.5、1、2、10、100μmol/mL)以及双丁酰环腺苷酸(dbcAMP)、异丁基黄嘌呤(IBMX)、PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKAs信号通路调节因子进行调控培养2h。利用精子活力计算机检测(CASA)、蛋白质免疫印迹(WB)技术,分析测定猪精子体外铬暴露获能培养过程中精子活力、蛋白磷酸化水平,并用相应试剂盒检测细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性、腺苷-3′,5′-环化一磷酸(cAMP)及ATP水平。结果表明:铬离子对猪精子活力、蛋白磷酸化水平有抑制作用,且随铬离子浓度增加抑制作用增强。当铬浓度达到2μmol/mL时精子活力MOT(58.4%)显著低于获能培养组(73.6%)(P0.05);10μmol/mL铬处理明显抑制蛋白磷酸化水平,且细胞内GAPDH活性、cAMP及ATP水平显著降低(P0.05)。而10μmol/mL铬处理中分别添加葡萄糖(5.0μmol/mL)及dbcAMP(1.0 mmol/L)和IBMX(0.1 mmol/L),能缓解铬对蛋白酪氨酸磷酸化(PTP)、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸化(P-PKAs)及GAPDH活性的抑制作用。结果提示铬可能是通过干扰糖代谢及cAMP/PKA信号通路影响猪精子活力及蛋白磷酸化水平。本研究首次探究了体外培养过程中铬离子对家畜精子活力的影响,并初步探究了其作用机理,为进一步研究铬离子引起繁殖毒性的分子机制及家畜繁育提供一定的理论基础。     

pH、盐度及K+、Ca2+和葡萄糖对萨罗罗非鱼精子活力的影响

【目的】确定萨罗罗非鱼精子活力最高时各因子的最佳参数,进一步提高尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂的受精率。【方法】利用显微镜观察对比不同梯度pH、盐度、离子及葡萄糖溶液中萨罗罗非鱼精子的活力状况,考察指标包括精子快速运动时间、寿命及激活率。【结果】pH 7.5~8.0时,萨罗罗非鱼精子激活率最高,达90%;在pH 7.5的条件下,精子快速运动时间和寿命最长,为66.33±2.25和933.17±25.79 s。在25‰~32‰的盐度范围内,萨罗罗非鱼精子活力较强,其中以30‰的精子活力最高,快速运动时间和寿命分别为63.50±2.35和402.50±7.31 s,激活率达90%。随K+浓度的增加,萨罗罗非鱼精子的快速运动时间、寿命及激活率均呈先升高后降低的变化趋势,其中以75 mmol/L的精子活力最高,精子寿命为500.33±8.69 s,激活率为90%。Ca2+对萨罗罗非鱼精子活力有明显抑制作用,其浓度为37.8 mmol/L时精子快速运动时间和寿命最长,分别为38.50±2.43和117.50±3.21 s,精子激活率为80%;而后随Ca2+浓度的增加,精子开始出现聚集现象,活力明显下降,Ca2+浓度增至151.2 mmol/L时,精子已完全失活。相对于K+和Ca2+,葡萄糖可适当延长萨罗罗非鱼精子寿命,其浓度为150 mmol/L时,精子寿命最长,为281.00±5.90 s,激活率达90%。【结论】针对尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂人工繁殖中受精率低的问题,生产上除了选择优质尼罗罗非鱼卵细胞、优化孵化环境及人工繁殖技术外,还可通过适宜游动介质参数(pH 7.5~8.0、盐度30‰~32‰、75~100 mmol/L K+、37.8 mmol/L Ca2+、100~125mmol/L葡萄糖)激活萨罗罗非鱼精子活力,进而提高其杂交受精率。     

不同稀释液对猪精子活力与保存时间的影响

通过研究不同配方的稀释液在相同的稀释倍数及同一保存条件下,对猪精子活力的影响来选择合适的猪精稀释液。试验选用灌南县家畜改良站内的4头成年公猪的精液作为材料,采用4种稀释液配方,分别进行稀释,观察精子活力和保存时间。结果表明,用葡—柠—乙液稀释的精液,在32h内精子活力平均数显著高于葡萄糖液和葡—柠液,精子存活时间也长于其它稀释液。     

Na+、 K+、 Ca2+、葡萄糖、 pH、温度对北方须鳅精子活力的影响

为了解北方须鳅 Barbatula barbatula nuda精子的生理特性, 研究了不同离子浓度、葡萄糖浓度、pH、温度等因子的变化对性成熟北方须鳅 (体质量为10～38 g) 精子活力的影响.结果表明: Na+浓度为68 mmol/L时, 北方须鳅精子活力最强, 快速运动时间 ( FT)、寿命 ( LT)、激活率...     

稀释液配方和稀释倍数对猪精子活力及运动参数的影响

为研究稀释液配方和稀释倍数对猪精子活力及运动参数的影响,筛选了5个稀释液配方,设计了6个稀释倍数,采用CASA系统检测精子活力、活动率、运动速度及运动方式等参数指标,利用SPSS 19.0软件中GLM程序进行分析表明,5个配方精子活力(PR)或精子活动率(PR+NP)中,F_2最高,F_3次之,但两者间差异不显著,与其他3个配方比较差异极显著;精子速度方面,同样以F_2最快,仍与F_3差异不显著,与其他配方差异显著或极显著;精子运动形式参数方面,WOB指标中,5个配方间差异均不显著;其他指标,F_2和F_3较高。稀释倍数上,就PR、PR+NP而言,两者均随稀释倍数的增大而表现出先上升后下降的趋势。因此,稀释液配方中,经典的猪稀释液配方为最优,确定配方为:葡萄糖5.0 g、柠檬酸钠0.3 g、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na);稀释倍数PR、PR+NP中,D_(0.5)最优,但从经济效益来看,D_1为最佳。     

小鼠精子体外培养过程中Ca~(2+)对微管蛋白乙酰化的影响

微管蛋白的乙酰化作用对细胞代谢过程,维持细胞的稳定性及运动性具有特殊作用,而有关哺乳动物精子蛋白乙酰化修饰的研究报道较少,且成熟精子蛋白乙酰化作用机制尚未明确。本研究利用精子活力参数计算机辅助检测(CASA)技术、蛋白免疫印迹(WB)以及免疫荧光等实验技术,分析测定小鼠精子体外培养过程中,不同浓度Ca2+以及HCO-3、环腺苷酸(dbcAMP)等精子获能调节因子对微管蛋白乙酰化的影响。结果表明,小鼠精子中分子量约为55、37、26kDa微管蛋白发生乙酰化修饰,获能培养后微管蛋白乙酰化程度明显高于未获能培养;钙离子对精子运动能力以及微管蛋白乙酰化修饰起双重调节作用,低浓度Ca2+(≤2.0mmol/L)促进精子活力及微管蛋白乙酰化(P0.05),而高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制精子活力MOT(48.88%)、曲线运动速度VCL(99.46μm/s)及微管蛋白乙酰化(P0.05);加入钙离子级联信号调节因子钙调蛋白抑制剂(W7)和钙调蛋白激酶抑制剂(KN-93),能有效缓解高浓度Ca2+(4.0mmol/L)对微管蛋白乙酰化的抑制作用,而钙离子载体(A23187)能进一步增强高浓度Ca2+对小鼠精子微管蛋白乙酰化的抑制作用;dbcAMP、异丁基黄嘌呤(IBMX)及PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKA磷酸化信号因子影响微管蛋白乙酰化,但不符合cAMP-PKA磷酸化信号通路调节规律。免疫荧光结果显示乙酰化微管蛋白主要分布在精子尾部的中段和主段,且主段最为明显。本研究提示Ca2+可能通过调节微管蛋白的乙酰化,从而影响精子的活力及受精能力。     

CdCl2对泥鳅精子运动的影响

以泥鳅(Misgurnus anguillkcaudatus)的精子为实验材料,在预实验的基础上,用浓度分别为0、50、100、200、400和800 μmol/L的CdCl2精子保存液孵育(4℃)泥鳅精子0、2、4、6和8h后,在显微镜下分别用含有相应浓度CdCl2的激活液激活(25℃),立即观察泥鳅精子的激活率、运动率、运动时间和运动速度.实验显示,CdCl2影响泥鳅精子的运动能力,呈现出明显的浓度和时间依赖性,CdCl2对泥鳅的受精可能具有抑制作用.     

褪黑素对热应激猪精子质量的影响

为研究褪黑素(Melatonin,MLT)对热应激引起的猪精子质量下降的缓解作用及其机制。首先用免疫荧光方法检测MLT受体在猪精子上的存在和分布;然后将稀释后的精子分为对照组(ck)、热应激组(H)、MLT组(M)、热应激+MLT组(H+M)、热应激+MLT受体拮抗剂Luzindole组(H+L)和热应激+MLT受体拮抗剂Luzindole+MLT组(H+L+M)6个组,处理结束后检测各组精子活率、活力、线粒体活性、钙离子水平以及顶体完整率。结果显示:猪精子中存在MLT受体MT1和MT2,且均分布于精子头部;与对照组相比热应激组各项指标显著下降,MLT组精子活率没有显著改变(P0.05),但精子活力、线粒体活性、钙离子水平和顶体完整率显著升高(P0.05)。添加MLT受体拮抗剂Luzindole后精子活力、线粒体活性和钙离子水平显著下降(P0.05),顶体完整率呈一定程度下降,但差异不显著(P0.05)。以上结果表明:热应激会导致猪精子质量显著下降,并且MLT能通过受体途径改善热应激对猪精子质量的影响,但同时也存在非受体介导的作用。     

双糖对冻融后猪精子质量的影响

在传统的Tris—柠檬酸—葡萄糖(TCG)稀释液基础上,分别添加0.1 mol/L乳糖、蔗糖、海藻糖,并采用细管法对精液进行冷冻,研究不同双糖对冻融后猪精液质量的影响。结果表明:0.1 mol/L的海藻糖和蔗糖相对于对照组和0.1 mol/L的乳糖TCG稀释液能够显著改善冻融后猪精子质量,其冻融后精子的活率、顶体完整率、低渗膨胀率、平均路径速度、运动线速度、平均侧摆幅度和平均鞭打频率均明显提高(P0.05),分别达到42.14%和40.56%,51.48%和49.84%,46.20%和43.01%,32.8μm/s和33.2μm/s,60.80%和59.00%,1.70μm和1.62μm,7.68 Hz和7.62 Hz。TCG稀释液中添加0.1 mol/L海藻糖和蔗糖的猪冷冻精液体外受精的受精能力明显高于0.1 mol/L乳糖组和对照组,其卵裂率分别为41%和38%。     

培养液pH值对小鼠精子体外培养过程中活力及蛋白修饰的影响

为了探究不同pH对小鼠成熟精子体外培养过程中活力参数及蛋白修饰的影响,研究采用不同pH值(6.6~7.8)培养液培养小鼠精子2h,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)、蛋白免疫印迹(WB)及免疫荧光技术,分析测定小鼠精子活力参数、蛋白修饰的变化情况,并对小鼠精子磷酸化蛋白及乙酰化蛋白进行细胞亚组分定位。结果显示,pH为7.2~7.4时精子能动性(sperm motility,MOT)、平均路径速度(path velocity,VAP)、平均直线运动速度(straight line velocity,VSL)和平均曲线运动速度(curvilinear veiocity,VCL)都有较高值,pH为6.6或7.8时精子活力受到显著抑制(P0.05);培养液的pH为7.4处理组,小鼠精子蛋白磷酸化、乙酰化和琥珀酰化修饰均达到较高水平,无论pH降低(7.2)还是升高(7.4)这些蛋白修饰水平都减弱,与精子活力参数变化趋势一致;免疫荧光定位结果显示,获能组磷酸化蛋白及乙酰化蛋白荧光强度明显高于未获能组,磷酸化蛋白及乙酰化蛋白遍布精子整个鞭毛区域,其中头部核区蛋白乙酰化修饰水平较高。上述研究表明pH值7.2~7.4为小鼠精子体外培养的最适pH值范围,pH值可能通过影响精子体外培养过程中的蛋白磷酸化、乙酰化及琥珀酰化作用调节精子活力及功能。本研究对探究pH值调控哺乳动物成熟精子活力的分子机理及体外培养具有重要意义。     

油菜素内酯对植物细胞钙离子分布的影响

【目的】明确油菜素内酯对Ca²⁺分布的影响,分析油菜素内酯对影响钙稳态的编码Ca²⁺通道和Ca²⁺-ATPase相关基因表达量的变化,明确油菜素内酯对钙稳态的影响。【方法】采用焦锑酸钙沉淀法对油菜素内酯（brassinosteroid,BR）处理后Ca²⁺的分布进行细胞化学定位;利用real-time PCR技术对调控细胞内Ca²⁺水平的位于细胞质膜、液泡膜和内质网上的编码Ca²⁺-ATPase的基因及位于细胞质膜、液泡膜和溶酶体上的编码Ca²⁺通道基因的表达量进行分析。【结果】在未经BR处理的拟南芥细胞中,Ca²⁺主要分布在细胞壁、细胞间隙和液泡中,细胞质和叶绿体中仅有少量Ca²⁺的分布;在1 µmol·L^-1 BR处理3 h后,Ca²⁺呈聚集状分布在液泡膜和细胞质膜附近,同时细胞质和叶绿体上的Ca²⁺分布增多;BR处理6 h后,细胞质和叶绿体中Ca²⁺分布继续增加,细胞壁中Ca²⁺分布有所减少;BR处理9 h后,细胞质和叶绿体中Ca²⁺分布减少,细胞间隙和液泡中Ca²⁺分布有所增加,但细胞壁中Ca²⁺分布明显减少,说明BR具有移除细胞壁中Ca²⁺的作用。CNGC2和CNGC12是细胞质膜上编码Ca²⁺通道的基因,在1 µmol·L^-1BR处理3 h后,CNGC2和CNGC12的表达量均明显下降;处理6 h后,CNGC2和CNGC12的表达量有所恢复;处理9 h后,CNGC2和CNGC12的表达量明显增加。TPC1和TPC2分别是液泡和溶酶体上钙离子通道相关基因,TPC1和TPC2的表达量在1 µmol·L^-1 BR处理3 h后也表现为明显下降,但TPC1的表达量在BR处理6 h后的表达量明显高于未用BR处理的对照,而TPC2的表达量直到BR处理9 h后才明显升高。可见,BR可阻滞细胞质中Ca²⁺浓度的快速上升,液泡膜上编码Ca²⁺通道基因的表达恢复早于细胞质膜和溶酶体上的Ca²⁺通道基因,说明液泡中Ca²⁺大量进入细胞质的时间早于胞外钙库和溶酶体等胞内细胞器。ACA8和ACA10是定位在细胞质膜上Ca²⁺-ATPase基因,1 µmol·L^-1 BR处理3和6 h后,ACA8和ACA10的表达量没有明显的变化;BR处理9 h后,ACA8和ACA10的表达量明显增加;ACA4和ACA11是液泡膜上编码Ca²⁺-ATPase的基因,BR处理后,ACA4和ACA11的表达量变化与质膜上的ACA8和ACA10的表达变化类似。ACA2是内质网上编码Ca²⁺-ATPase的基因,ACA2的表达量同样在BR处理9 h后出现了表达量的最高峰。可见,BR处理9 h后,Ca²⁺-ATPase表达量增加,把细胞质中高浓度的Ca²⁺泵入细胞间隙、液泡和内质网等胞外和胞内钙库中,调控细胞质中的Ca²⁺稳态。【结论】BR对第二信使Ca²⁺具有调控作用,并可通过对钙稳态调控系统的调控传递信号。     

低温胁迫下棉花幼苗对外源钙的生理响应

为提高棉花幼苗抗冷性,以冷敏感性基因型棉花品种新陆早12号为材料,人工模拟北疆棉区早春气候特点,分别用不同浓度(10、15、20、25、30mmol/L)CaCl2、Ca(NO3)2和CaAc2喷施棉花幼苗,5℃低温胁迫3d后测定棉花幼苗体内主要生理指标含量的变化,研究低温胁迫下棉花幼苗对外源钙的生理响应。结果表明,3d低温胁迫使棉花幼苗受到明显伤害,CaCl2、Ca(NO3)2和CaAc23种钙盐能在一定程度上降低低温对棉花幼苗的伤害,但不同种类钙盐的有效作用浓度不同,其中以CaCl2作用效果最佳。适当浓度的CaCl2处理可以显著降低棉花幼苗的冷害指数、叶片相对电导率和丙二醛的积累量,提高抗氧化酶活性和渗透调节物质的含量,有效减轻低温胁迫对棉花幼苗的伤害。     

不同冷敏感型甘蔗茎尖Ca2+和Ca2+-ATP酶活性对低温的响应

为了探明不同冷敏感型甘蔗品种茎尖Ca2+和Ca2+-ATP酶活性对低温胁迫的响应机制,本研究利用植物组织化学技术结合电子显微镜观察了2个不同冷敏感型甘蔗品种茎尖在低温胁迫前后Ca2+和Ca2+-ATP酶的变化规律.供试品种为桂糖28号(抗冷型)和园林6号(冷敏感型),在0℃条件下,分别处理0、2、4和6 d后切取茎尖进行组织化学定位,获得如下结果:1)低温胁迫前后桂糖28号形态和细胞结构变化不明显,但园林6号发生质壁分离现象,线粒体空泡化,细胞崩溃,组织水溃状明显;2)低温胁迫开始,2个甘蔗品种细胞质和细胞核Ca2+沉淀颗粒均增多,但随着低温胁迫时间的延长桂糖28号细胞质和细胞核Ca2+沉淀颗粒减少,并维持在一个低稳态水平,而园林6号细胞质和细胞核一直维持在高Ca2+浓度水平;3)低温对桂糖28号Ca2+-ATP酶活性与分布影响不大,其活性一直维持在较高水平,而园林6号Ca2+-ATP酶活性随着低温胁迫时间的延长而变弱.结果说明,低温条件下细胞质和细胞核Ca2+浓度增高是导致甘蔗茎尖细胞受伤害的重要原因,维持较高Ca2+-ATP酶活性有助于避免Ca2+-中毒.