利用RK2的parDE片段提高重组质粒在生防菌成团泛菌中的稳定性

用ＰＣＲ方法将广宿主范围质粒ＲＫ２中控制稳定性的片段ｐａｒＤＥ克隆到ｐＧＥＭ┐Ｔ载体上,然后插入到分泌表达载体ｐＥｘＳｅｃ１的ＢａｍＨＩ切点上,得到两个新载体ｐＺＬ２和ｐＺＬ３,其中ｐａｒＤＥ的转录方向分别与Ｔ７启动子相同和相反。经酶切物理图谱分析和ＰＣＲ扩增验证后,将ｐＺＬ２和ｐＺＬ３分别电击转化到成团泛菌３０８Ｒ中,在无抗生素的ＬＢ培养基中生长１００代后仍１００％地保留在细胞内。新质粒在植物叶面生长的细胞内也１００％稳定     

RT-PCR检测李坏死环斑病毒的研究

为了从植物组织中快速检测李坏死环斑病毒９ＰＮＲＳＶ）,根据该病毒ＲＮＡ３序列设计引物,对感病和健康组织总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果从感病组织中扩增出了大约４５０ｂｐ的目的片段,而健康组织中无此扩增带。将此ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ载体也能转化大肠杆菌ＤＨ５５α菌株,得到了含有目的片段的重组子。并采用双脱氧终止法进行序列配美国报道的李坏死环斑病毒ＲＮＡ３序列对应部分核苷酸基本一致,这表     

杆状病毒表达猪传染性胃肠炎病毒钉状蛋白在血清学诊断上的应用

用从猪传染性胃炎病毒（ＴＧＥＶ）强毒Ｍｉｌｌｅｒ株（Ｍ５Ｃ）克隆建立的一株的重组杆状病毒（Ｒ２－２）表达的重组ＴＧＥＶ钉状糖蛋白（Ｓｐｉｋｅ，Ｓ）建立了一种阻断酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来检测猪群中抗ＴＧＥＶ抗体。实验表明，用重组病毒Ｒ２－２接种昆虫传代细胞系Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ｓｆ９），所表达的重组蛋白量在接种后第７２小明达到最高值；该重组蛋白能与抗ＴＧＥＶ Ｓ蛋白Ａ     

RT－PCR检测烟草环斑病毒的研究

本文报道应用ＲＴ一ＰＣＲ技术检测烟草环斑病毒（ＴＲＳＶ）的结果。根据ＴＲＳＶＲＮＡ－２序列３末端非编码区设计、合成引物一１和引物一２；用ＴＲＳＶＲＮＡ作模板，引物一２作引物，反转录合成ｃＤＮＡ，并以此作模板进行ＰＣＲ扩增，５～６小时内可得到结果，检测粗提液中ＲＮＡ灵敏度达４００ｐｇ，并且可以直接从受侵染的叶片汁液中检出ＴＲＳＶ，为口岸快速检疫推出一个更灵敏、准确的分子生物学新方法。值得推广应用。     

RT—PCR检测烟草环斑病毒的研究

本文报道应用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测烟草环斑病毒（ＴＲＳＶ）的。根据ＴＲＳＶＲＮＡ－２序列３末端非编码区设计，合成引物－１和引物－２；用ＴＲＳＶＲＮＡ作模板，引物－２作引物，反转录合成ｃＤＮＡ，并以此作模板进行ＰＣＲ扩增，５－６小时内可得到结果，检测粗提液中ＲＮＡ灵敏度达４００ｐｇ，并且可以直接从受侵染的叶片汁液中检出ＴＲＳＶ，为口岸快速检测疫推出一个更灵敏、准确的分子生物学新方法。值得推广应用。     

木霉对土传病原尖孢镰刀菌的拮抗作用

木霉对土传病原尖孢镰刀菌的拮抗作用王伟赵谦杨微（东北农业大学植保系，哈尔滨１５００３０）ＡＮＴＡＧＯＮＩＳＭＯＦＴＲＩＣＨＯＤＥＲＭＡＶＩＲＩＤＥＴ２ＡＧＡＩＮＳＴＳＯＩＬ┐ＢＯＲＮＥＦＵＳＡＲＩＵＭＰＡＴＨＯＧＥＮＳＷＡＮＧＷｅｉＺＨＡＯＱｉａｎＹ...     

利用人工卵大量繁殖赤眼蜂及其田间防虫试验概况

利用人工卵大量繁殖赤眼蜂及其田间防虫试验概况刘建峰刘志诚冯新霞李敦松（广东省农科院植物保护研究所,广州５１０６４０）ＰＲＥＳＥＮＴＳＴＡＴＵＳＯＦＭＡＳＳ┐ＲＥＡＲＩＮＧＴＲＩＣＨＯＧＲＡＭＭＡＷＩＴＨＡＲＴＩＦＩＣＩＡＬＨＯＳＴＥＧＧＳＴＯＣＯＮＴ...     

利用同源菌株融合改良农抗5102产生菌——吸水链霉菌应城变种的研究

利用同源菌株融合改良农抗５１０２产生菌——吸水链霉菌应城变种的研究ＳＴＲＡＩＮＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮＴＯＦＡＮＴＩＢＩＯＴＩＣ５１０２ＰＲＯＤＵＣＩＮＧＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳＨＹＧＲＯＳＣＯＰＩＣＵＳＶＡＲ．ＹＩＮＧＣＨＥＮＧＥＮＳＩＳＢＹＰＲＯＴＯ...     

黄瓜花叶病毒运动蛋白基因及其缺失突变体在大肠杆菌中的表达和表达产物的纯化

利用ＣＭＶＦｎｙ 株系ＲＮＡ３ 全长ｃＤＮＡ 克隆, 构建了运动蛋白（ＭＰ） 基因５′端缺失突变体和３′端缺失突变体的原核表达载体。ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 分析表明, 经ＩＰＴＧ 诱导, ＭＰ 基因及其２ 种缺失突变体均能在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ中高效表达。利用分离包含体的方法, 提纯了全长的及Ｃ 端缺失的ＭＰ。光密度扫描分析表明, 提纯产物的纯度达９６ ．６ ％ 。     

贵州烟仓昆虫天敌初步观察

贵州烟仓昆虫天敌初步观察①高念昭（贵州农学院植保系，贵阳５５００２５）ＰＲＥＬＩＭＩＮＡＲＹＯＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳＯＦＮＡＴＵＲＡＬＥＮＥＭＩＥＳＯＮＳＴＯＲＥＤＴＯＢＡＣＣＯＩＮＳＥＣＴＰＥＳＴＳＩＮＧＵＩＺＨＯＵＧＡＯＮｉａｎ－ｚｈａｏ（Ｄｅｐ...     

抗草甘膦基因的克隆及在原核表达系统中的功能分析

为了克隆抗草甘膦基因并在原核表达系统中分析其抗性水平,利用200 μmol/L草甘膦平板从草甘膦严重污染的土壤中筛选到1株抗草甘膦菌株G6PP,经电镜和16S rDNA鉴定为恶臭假单胞菌;以该菌株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增出5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶(EPSPS)基因,该基因编码440个氨基酸,亚克隆到原核表达载体pEET-28a中构建原核表达载体pET-G6;将重组表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导,表达出46 ku的融合蛋白;携带pET-G6质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在液体M63培养基中能耐受150 μmol/L草甘膦的抑制.本研究结果表明克隆到的G6基因具有一定的抗草甘膦活性,对抗草甘膦作物的培育具有实践意义.     

Harpin蛋白基因的克隆及序列分析

 以梨火疫病细菌基因组DNA为模板,通过合成5'-端及3'-端一对特异引物,利用多聚酶链式反应(PCR)扩增获得harpin蛋白基因。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明:基因由1155个核苷酸组成,编码385个氨基酸残基组成的多肽。与发表序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为99.31%和98.96%。     

菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒EP-1-like基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备方法

本实验提取被菜蛾盘绒茧蜂寄生后24h的小菜蛾幼虫体内总RNA,反转录合成cDNA,以此为模板PCR扩增出菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒(Cotesia vestalis polydnavirus,CvBV)EP-1-like基因,将其分别克隆到表达载体pET30a、pET28a中,转化宿主菌BL21(DE3),获得单克隆重组质粒pET-30a-EP1L和pET-28a-EP1L。经IPTG诱导,pET-28a-EP1L成功表达了约34.8kDa的包涵体蛋白。将诱导条件优化以后,采用割胶回收的方法纯化包涵体,将纯化后的表达蛋白免疫新西兰大耳兔制备多克隆抗体。ELISA分析表明制备的抗体效价达1:128000,Western blot检测证明抗体具有良好的免疫反应特异性。     

烟草环斑病毒RT-Realtime PCR检测方法

烟草环斑病毒(Tobacco ringspotvirus,TRSV)是我国公布的二类检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。受该病毒侵染的一些寄主植物出现隐症,并伴随病毒浓度降低,给检测工作造成困难。根据TRSV外壳蛋白基因序列设计合成了一对引物及一条MGB探针,优化了反应条件,建立了TRSV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与常规的DAS-ELISA方法和RT-PCR方法相比,灵敏度分别提高了200倍和4倍,并且对不同寄主上的TRSV均有较好的检测效果。     

葡萄卷叶伴随病毒-3外壳蛋白的原核表达及其特异性抗血清的制备

利用RT-PCR技术扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒-3(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)中国分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)基因。序列分析结果表明,cp基因的长度为942bp,与已报道的其它GLRaV-3分离物的cp核苷酸相似性为91%～99%,编码的氨基酸相似性为95%～100%。将此基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,cp在大肠杆菌中可表达出分子量约为35kDa的蛋白。纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)及斑点免疫结合测定(DBIA)结果显示,制备的特异抗血清可用于检测田间感病葡萄样品中的GLRaV-3。     

茉莉H病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清制备

茉莉H病毒(jasmine virus H,JaVH)是近年来引起茉莉病毒病的一种新病毒,Zhuo等[1]在我国福建黄化嵌纹的茉莉上首次发现并报道,随后Dey等[2]在美国夏威夷和华盛顿也发现了 JaVH,并认为其是引起茉莉病症不可或缺的致病因子之一.     

单管实时荧光RT PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒

 本研究建立了大豆种子中菜豆荚斑驳病毒（BPMV）和烟草环斑病毒（TRSV）单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受两种病毒侵染的大豆种子作为待测样品进行实时荧光PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中,二者的检测限相当,均可达到35 pg/mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性更强,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。     

香石竹斑驳病毒的鉴定和RT-PCR检测

从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,电镜负染观察到直径为28～33nm的球状粒子。病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 ,OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.70;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。通过以上实验结果 ,确定该病毒分离物为香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus ,CarMV)。根据该病毒的RNA序列设计引物 ,对病健材料进行了RT-PCR检测 ,结果从感病材料中扩增出大约600bp的特异片段 ,而健康植物无此扩增带。将PCR产物连接 pGEM-T-easy载体 ,转化大肠杆菌JM109,得到了含目的片段的重组子 ,经双脱氧序列分析 ,与Guilley报道的序列对应部分的核苷酸序列基本一致 (其同源性达96% ) ,最低检出病毒核酸含量为5ng ,表明应用RT-PCR检测香石竹斑驳病毒是可行的     

泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白抗血清的制备及应用

 根据报道的泡桐丛枝植原体(Paulownia witches’-broom phytoplasma,PaWB)抗原膜蛋白(antigenic membrane pro-tein,AMP)基因的核苷酸序列设计引物,提取发病泡桐总DNA,经PCR扩增并成功克隆泡桐丛枝植原体amp基因。序列分析表明,amp基因由696个核苷酸组成,编码231个氨基酸残基,与GenBank中登录的2个泡桐丛枝植原体的膜蛋白核苷酸序列同源性为100%。将amp基因91-604 nt部分序列(命名为ampd)克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,诱导后,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表明融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以纯化的带GST标签的AMPD融合蛋白为抗原免疫德国大白兔,制备了PaWB-AMPD抗血清。利用该血清,通过Western印迹、点印迹、ELISA、间接免疫荧光和免疫捕获PCR试验均能在发病泡桐组织中特异检测到泡桐丛枝植原体。