实时荧光RT-PCR检测香蕉苞片花叶病毒方法的建立

香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus, BBrMV)是我国对外检疫性有害生物。为防止该有害生物传入我国,根据BBrMV不同分离株外壳蛋白基因(coat protein, CP)的保守序列,设计特异性引物与TaqMan荧光探针,建立了BBrMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测BBrMV的2个不同来源毒株,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为26.65和27.52;而马铃薯Y病毒、李属坏死环斑病毒以及桃丛簇花叶病毒等其它毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高1000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对BBrMV的检测。     

香蕉苞片花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

本试验成功构建了香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus,BBrMV)外壳蛋白(coat pro-tein,CP)基因的原核表达载体,并诱导表达了34 kDa的融合蛋白His.CP。对该原核表达蛋白的可溶性分析表明,该融合蛋白以包涵体形式存在。利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的蛋白进行了纯化,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的蛋白为抗原免疫健康家兔,成功制备了抗BBrMV CP基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting结果表明这种抗血清有很强的特异性。血清效价测定的效价在51 200倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1:800～1:3 200。     

香蕉上两种病毒在香蕉分化芽中的PCR检测

香蕉线条病毒Banana streak virus（BSV）引起的香蕉线条病，与黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus（CMV）引起的香蕉花叶心腐病初期症状相似，香蕉Musa spp．感染这两种病毒后，产量和品质都受影响，防治香蕉病毒病的有效方法之一是种植无毒试管苗。通过检测香蕉分化芽中CMV，减少了香蕉花叶心腐病在广东的发生。[第一段]     

黄瓜花叶病毒NASBA检测技术的建立

 以香蕉花叶病病样为材料,初步建立了黄瓜花叶病毒核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence based amplifica-tion,NASBA)的检测技术。通过以香蕉叶片总RNA为模板,在黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)亚组ⅠRNA 2高保守区设计特异引物,进行NASBA反应,经5%琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品中出现了预期大小为310 bp的条带,而阴性和空白对照中均未出现。并对11份香蕉样品分别进行NASBA反应,并经过斑点杂交验证与RT-PCR检测比较,两者的检测结果一致,灵敏度相当,检出限量可达100 pg。     

百合黄瓜花叶病毒及其检测

应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了浙江丽水和杭州的东方百合、亚洲百合等栽培品种上黄瓜花叶病毒(CMV),64个田间样品中有26个带毒,检出率为40.6%;dsRNA检测结果与已知CMV-FQS株系的电泳条带相同,但百合组织中CMVdsRNA含量较低;电镜观察,受CMV侵染的样品中大多含有线状病毒,复合侵染率为35.9%;寄主反应测定显示从百合植株上获得的CMV株系均不能通过汁液摩擦接种侵染昆诺藜、苋色藜、普通烟、心叶烟等6科10种指示植物。     

大豆花叶病毒种子带毒检测的研究

带毒种子是大豆花叶病初侵染的唯一来源,种子带(传)毒率高低影响田间发病基数和病害的扩展流行,也是评价品种抗性的一个重要指标。因此,摸清和掌握大豆品种的带(传)毒情况及检测方法,在生产中有重要的经济意义。为此,我们在筛选种传率低的品种过程中,对此项工作做了初步摸索。     

香蕉枯萎病检测技术和防治措施

香蕉枯萎病4号小种是部分省级补充检疫性对象。对香蕉枯萎病4号小种的检测技术及其综合防治措施进行了探讨。     

进境大丽花种子携带大丽花花叶病毒的分子检测

通过生长性试验、症状观察、PCR扩增及序列测定,从一批进境的大丽花种子上发现大丽花花叶病毒(Dahlia mosaic virus,DMV)。序列比对结果表明,发现的DMV分离物与DMV-D10存在较近的亲缘关系。根据已报道引物P3/P4的测序结果,并将其与已有的DMV序列进行比对,设计1对预期扩增片段为750 bp的检测引物P5/P6。实验结果证实,P5/P6的扩增效率优于已报道的引物P1/P2和P3/P4,适用于DMV的分子检测。     

玉米矮花叶病毒种子传毒率检测

 玉米矮花叶病流行危害,种子带毒是重要原因。     

香蕉3种主要病毒的多重PCR检测

根据香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和香蕉线条病毒(Banana streak virus,BSV)3种病毒核酸保守序列设计相应特异性引物,通过体系优化,建立了可以同时检测香蕉束顶病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉线条病毒的多重PCR体系。     

利用DAS-ELISA进行番茄花叶病毒的田间检测

 从制备的番茄花叶病毒(ToMV-S1)抗血清中提纯IgG,并用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,建立了检测ToMV的DAS-ELISA系统。利用此检测系统并结合生物学方法,对浙江及山西等地的田间病样进行测定,结果发现茄子、番茄等茄科作物中均有ToMV的侵染,其中茄子中有50%左右的发生率,番茄中ToMV发生率南北差异较大,在浙江发生率仅为10%左右,而在山西有60.7%的发生率,辣椒中未测到ToMV。这是在我国首次进行ToMV的田间发生情况检测。     

RT—PCR检测南方菜豆花叶病毒

根据南方菜豆花叶病毒（ＳＢＭＶ）两株系Ｂ和Ｃ的核酸序列设计两对引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ可以特异地区分纯化的和０．２ｇ病叶中的两株系，ＲＴ－ＰＣＲ检测ＳＢＭＶ－Ｂ的灵敏度为１０ｐｇ。     

逆转录环介导等温扩增技术检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了2组RT-LAMP引物,通过筛选试验,最终确定Ar4组引物为最佳引物,建立了南芥菜花叶病毒的RT-LAMP检测方法.同时,通过实时浊度仪和钙黄绿素分别对检测结果进行了判断.特异性和灵敏度试验结果显示,RT-LAMP方法快速、特异且灵敏,其灵敏度与普通RT-PCR法一致.     

一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒

本文在两步RT-PCR检测ZYMV的基础上进行了一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的实验,并对商品化一步法RT-PCR试剂盒和本文实验的一步法RT-PCR的效果和成本进行了比较,最终建立了一种比较实用的检测ZYMV的方法.     

逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒

 根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了4组RT-LAMP引物,通过引物筛选试验,确定SB1组引物为最佳引物,并进行了引物特异性与灵敏度检测试验,最终建立了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。灵敏度检测试验显示,RT-LAMP方法比普通RT-PCR法灵敏度高10倍,而检测时间明显缩短,整个反应过程只需40 min。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可裸眼观察颜色变化来判定结果。本研究所建立的SBMV RT-LAMP方法具有快速、稳定、灵敏、特异、操作简单的特点,适合于SBMV的现场快速检测。     

利用RT-PCR方法检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒

通过设计特异性引物SQCPF/SQCPR,扩增南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)CP基因的保守序列,进行RT-PCR,对扩增得到的特异性片段进行序列测定,测序结果显示扩增产物序列与GenBank中登录的SqMV外壳蛋白基因存在87%～96%的一致性;建立了适用于检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒的RT-PCR结合ELISA方法,通过在酶联板的反应孔中直接进行反转录合成cDNA,能扩增到预期大小的DNA条带,且检测灵敏度高于DAS-ELISA方法10倍以上。用建立的RT-PCR结合ELISA方法检测进境甜瓜种子携带的SqMV,在42份样品中检出4份阳性样品。     

香蕉穿孔线虫双重PCR快速检测技术研究

 香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)是国际上公认的植物检疫性有害生物之-, 是热带地区果树上最重要的线虫。通过设计的属水平上的特异性引物R1、R2(R1/2)和种水平上的特异性引物RS1、RS2(RS1/2)进行双重PCR扩增香蕉穿孔线虫, 可扩增出长度为362和291 bp的2个特异性片段谱带。同时分别对检测体系中反应参数进行优化, 最佳延伸温度为51.4℃, 引物R1/2与RS1/2最佳浓度配比为0.2μmol·L^-1/1.2μmol·L^-1, 并测试检测引物的灵敏度, 能进行有效检测的最低起始核酸量为100 pg;同时, 也能对单条线虫进行检测以及样品中线虫的检测。专化性测试证明, 2对引物能有效地进行香蕉穿孔线虫的快速分子诊断。     

香蕉枯萎病的检测与监控

香蕉枯萎病菌4号小种的发生与蔓延对我国香蕉产业造成严重危害，加强检疫和监控力度具有,重要意义。本文介绍了该菌的分离培养检测、PCR及营养体亲和性（VCG）等检测方法。与传统分离鉴定相比较，PCR与VCG技术相结合，能够提高香蕉种苗质量的检测水平。此外，本文还从多个方面对香蕉枯萎病的防治进行探讨。