Ghrelin对水牛体外受精和孤雌激活胚胎体外发育的影响

本研究的目的是探讨Ghrelin对水牛体外受精和孤雌激活胚胎体外发育的影响.体外成熟的水牛卵母细胞经体外受精或离子霉素孤雌激活后.分别在舍0,0.5,5,50和500 μg/L Ghrelin的培养液中进行体外培养,观察各组胚胎的卵裂率和囊胚率.结果显示,在培养液中添加不同浓度的Ghrelin对体外受精和孤雌激活胚胎的卵裂率均无显著影响(P>0.05),但添加500 μg/L的Ghrelin显著提高体外受精胚胎的囊胚发育率(33.5% vs 13.7%,P<0.05),50 μg/L或500 μg/L的Ghrelin均显著提高孤雌激活胚胎的囊胚发育率(32.4%和34.6% vs 14.5%,P<0.05).结果表明,培养液中添加Ghrelin对胚胎的早期卵裂没有影响,但可促进水牛体外受精和孤雌激活胚胎囊胚的形成.     

猪胚胎早期卵裂时间与其发育潜能关系的初步研究

旨在探讨初次卵裂时间对猪孤雌胚胎发育潜能及其基因相对表达水平的影响。本试验从健康母猪卵巢上抽取卵母细胞进行体外成熟培养，将猪孤雌激活胚胎分为早期卵裂组（16~22 h）与晚期卵裂组（26~32 h）统计比较卵裂率和囊胚率，并对囊胚的多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4等和凋亡相关基因Bcl-xl、Bax、Caspase-3的相对表达水平进行分析检测。结果表明，猪孤雌激活胚胎在16~22 h发生卵裂的为50%~60%，而26 h之后发生卵裂的不到20%，在18 h前完成第一次卵裂的胚胎囊胚发育率为79%，42 h后发生初次卵裂的胚胎无法发育至囊胚期。猪孤雌激活胚胎早期卵裂组的囊胚发育率显著高于晚期卵裂组（P<0.05）。早期卵裂组囊胚的Oct4、Nanog、Sox2、Klf4基因的表达量显著高于晚期卵裂组（P<0.05），Oct4、Sox2、Klf4基因的相对表达量极显著高于晚期卵裂组（P<0.01），Bax和Caspase-3基因的相对表达水平极显著低于晚期卵裂组（P<0.01），而Bcl-xl作为保护因子其表达量相对于晚期卵裂胚胎（26~32 h）显著上调（P<0.05）。结果显示，初次卵裂时间较早的猪孤雌激活胚胎发育潜能显著高于较晚卵裂胚胎，其囊胚多能性相关基因表达上调，凋亡相关基因表达下调，卵裂时间可作为鉴定猪孤雌激活胚胎发育潜力的重要参数。     

柠檬苦素对小鼠卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎发育的影响

【目的】研究柠檬苦素(limonin,Lim)对小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)及后续体外受精(IVF)胚胎发育潜能的影响,旨在为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】在小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度的Lim(0、10、20、50 μmol/L),成熟培养12 h后统计小鼠卵母细胞第一极体(PBI)排出率,筛选体外成熟培养液中添加Lim的最适浓度;在体外成熟培养液中添加最适浓度的Lim,以0 μmol/L Lim为对照组,成熟培养12 h,通过免疫荧光染色检测活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)以及线粒体膜电位(MMP)水平;通过实时荧光定量PCR检测卵母细胞抗氧化及凋亡相关基因的mRNA表达水平。将最适Lim组及对照组卵母细胞体外成熟24 h后进行体外受精,于体外受精24 h和3.5 d分别统计胚胎卵裂率和囊胚率,并用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342染色分别检测囊胚总细胞数及囊胚内凋亡细胞比率。【结果】与0 μmol/L Lim组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞PBI排出率显著升高(P＜0.05),后续试验均用20 μmol/L Lim进行处理。与对照组组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05),GSH、MMP水平均显著增加(P＜0.05),抗氧化相关基因(GPx3、CAT和Prdx3)、抗凋亡相关基因(Bcl-2、Bcl-xl)表达水平均显著上调(P＜0.05),促凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平显著下调(P＜0.05);体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均显著增加(P＜0.05),囊胚内细胞凋亡比率显著下降(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养液中添加20 μmol/L Lim可以通过抑制氧化应激和细胞凋亡、增加MMP水平提高小鼠卵母细胞质量,从而提高体外受精胚胎的发育潜力。     

猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活参数研究

本研究比较了按不同方法贮藏的培养液对猪卵母细胞体外成熟及成熟后孤雌激活对胚胎发育的影响。此外,还探索了针对初情期前母猪体外成熟卵母细胞和孤雌激活方案。结果如下：①1.4 kv/cm、100 μs、1DC电激活后,卵母细胞死亡率明显高于2.0 kv/cm、30 μs、1DC和2.0 kv/cm、60 μs、1DC处理组,但激活后胚胎卵裂率和囊胚率相似;②使用钙离子载体和6-二甲基氨基嘌呤（Ionomycin+6-DMAP）处理后,胚胎卵裂及囊胚率都明显不如电激活处理;③6次独立试验结果证明：经4℃冷藏和-20℃冷冻保存的培养液用于猪卵母细胞培养,其体外成熟率、孤雌激活后的卵裂率及囊胚发育率无显著差异（P＞0.05）。说明成熟卵在2.0 kv/cm、30 μs、1DC或者 2.0 kv/cm、60 μs、1DC电击参数激活下可以降低死卵率;按本试验设计的电激活方案处理初情期前母猪成熟卵优于化学激活;在-20℃冷冻保存猪卵母细胞成熟液是可行的。      

KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响

旨在探讨KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响。本研究在体外成熟液中添加不同浓度的KDM1A特异性抑制剂GSK-KDM1A,牦牛卵丘-卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后,观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况;利用免疫荧光检测体外培养过程中卵母细胞内KDM1A的表达模式;采用实时荧光定量PCR检测体外培养卵母细胞内Kdm1a、Oct-4、Sox-2以及Nanog的表达水平;体外培养成熟后的牦牛卵母细胞进行体外受精,观察其卵裂率与囊胚形成率。结果显示,体外培养24 h后,GSK-KDM1A组的卵丘细胞扩展程度显著低于对照组（P<0.05）,而320 nmol·L^-1组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率均显著低于160 nmol·L^-1组（P<0.05）。在卵母细胞体外成熟过程中,Kdm1a呈现动态表达模式,MⅠ期的表达水平显著低于GV和MⅡ期（P<0.05）;添加GSK-KDM1A能显著抑制卵母细胞中KDM1A蛋白的表达（P<0.05）,320 nmol·L^-1组各时间点KDM1A的表达量均显著低于160 nmol·L^-1组（P<0.05）。GSK-KDM1A组卵母细胞内Oct-4与Sox-2的表达水平显著高于对照组（P<0.05）,但Nanog的表达水平无显著差异（P>0.05）。牦牛卵母细胞体外成熟后,GSK-KDM1A组的卵裂率显著低于对照组（P<0.05）,但囊胚形成率无显著变化（P>0.05）。综上表明,KDM1A参与调控牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程,GSK-KDM1A能有效抑制KDM1A的表达,影响卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能,揭示KDM1A在此过程中扮演重要角色。     

虾青素对猪卵母细胞体外成熟的影响

本研究旨在探讨虾青素(astaxanthin, Ast)对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎发育的影响,为进一步优化猪卵母细胞体外成熟培养体系提供参考。首先,将GV期猪卵母细胞培养在添加有不同浓度虾青素(0,5,10,20,40μmol/L)的体外成熟液中,40～44 h后统计第一极体排出率。结果显示与对照组相比,各处理组卵母细胞的第一极体排出率均显著升高(P<0.05),其中10μmol/L处理组卵母细胞的第一极体排出率显著高于5,20,40μmol/L处理组(P<0.05)。随后对MⅡ期卵母细胞进行孤雌激活处理,结果发现10μmol/L和20μmol/L处理组的卵裂率和囊胚发育率显著高于对照组(P<0.05),且10μmol/L处理组囊胚发育率显著高于20μmol/L处理组(P<0.05)。最后,检测虾青素处理后MⅡ期卵母细胞的活性氧水平、丙二醛及谷胱甘肽的含量,以及整个胚胎发育阶段中抗氧化酶相关基因SOD1和GPX4的表达变化,发现GV期卵母细胞经10μmol/L虾青素处理后,孤雌激活囊胚的细胞数极显著升高(P<0.01);而MⅡ期卵母细胞的活性氧水平...     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

对MⅡ期水牛卵母细胞进行人工诱导激活可以帮助人们间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,并且,卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一.试验比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较.结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27h或30h的囊胚发育率(19.0%or 17.7%)明显高于体外成熟21h或24h的囊胚发育率(12.3%or 13.8%);Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚(13.0%vs.21.7%).     

α-硫辛酸对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

为探究α-硫辛酸（ALA）对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响，本实验将不同浓度的ALA(0、10、25、50μmol/L)添加至体外成熟培养液（IVM）和胚胎发育培养基（PZM-3）中培养，体外成熟培养42 h后检测卵母细胞第一极体排出率，统计卵母细胞孤雌激活胚胎48 h和168 h卵裂率和囊胚率，筛选出ALA最佳添加浓度，并通过检测成熟卵母细胞内活性氧（ROS）水平、谷胱甘肽（GSH）含量、体外成熟卵母细胞内的促凋亡基因Bax的mRNA以及抗氧化基因SOD1、CAT的mRNA表达量，分析ALA在卵母细胞成熟中的作用。结果表明：与对照组相比，25μmol/L ALA组提高了猪卵母细胞第一极体排出率（P<0.05），随着ALA浓度增加，卵母细胞的第一极体排出率呈下降趋势，50μmol/L ALA组降低了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）；孤雌胚胎发育能力检测显示，25μmol/L ALA组卵母细胞的卵裂率和囊胚率高于对照组（P<0.05）；与对照组相比，25μmol/L ALA孵育组卵母细胞内ROS水平降低（P<0.05），细胞内GSH含量提高（P<...     

不同方法对滩羊卵母细胞孤雌激活及重构胚发育影响的研究

旨在探索宁夏滩羊卵母细胞孤雌激活及胚胎培养条件,并建立转Cherry基因滩羊体细胞重构胚的融合与体外培养体系。试验分析了3种激活方法即电激活、Ionomycin结合6-DMAP与电激活结合6-DMAP对成熟的滩羊卵母细胞激活的影响,以及3种胚胎培养液mSOFaa、M16和KSOM的培养筛选,并优化了滩羊体细胞重构胚的融合与体外培养条件。结果表明:在卵母细胞孤雌激活中,最适电压为1 600V/cm,获得卵裂率和囊胚率分别为58.5%和19.5%;5μmol离子霉素结合2 mmol 6-DMAP能有效地激活成熟的滩羊卵母细胞,卵裂率为81.0%,囊胚率为26.2%;并发现mSOFaa胚胎培养液的卵裂率和囊胚显著优于M16和KSOM培养液;在转基因重构胚融合中发现在电压1 800V/cm、脉冲时间10μs、脉冲次数2次和间隔时间为1s的条件下,卵裂率和囊胚率为40.0%、21.4%。本试验建立的滩羊孤雌激活和转基因重构胚融合与体外培养体系为宁夏滩羊的分子育种奠定了基础。     

SIRT1对牦牛卵母细胞体外成熟与老化的影响

旨在探索SIRT1在牦牛卵母细胞体外成熟与老化过程中的作用。本研究在体外成熟液中分别添加SIRT1特异性激动剂SRT2104（SRT组）和特异性抑制剂Inauhzin（INZ组），牦牛卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后，观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况；利用免疫荧光检测体外培养24与36 h后卵母细胞内的ROS水平；采用实时荧光定量PCR法检测体外培养24与36 h后卵母细胞内SIRT1、FOXO3a、SOD2以及Bax的表达水平；体外培养24与36 h后的牦牛卵母细胞进行体外受精，观察并统计其卵裂率与囊胚形成率。结果显示，体外培养24 h，SRT组的卵丘细胞扩展程度显著高于对照组（P<0.05），而INZ组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率显著低于对照组（P<0.05）。随着体外培养时间的增加，卵母细胞内的ROS水平显著增加（P<0.05）；添加SRT2104能显著抑制卵母细胞中ROS水平的积累（P<0.05），而添加Inauhzin则显著上调卵母细胞内的ROS水平（P<0.05）。体外培养24 h后，SRT组SIRT1、FOXO3a与SOD2的表达水平显著高于对照组（P < 0.05），但Bax的表达水平显著降低（P<0.05）；INZ组的SIRT1、FOXO3a与SOD2表达均显著低于对照组（P<0.05），但Bax的表达水平显著上调（P<0.05）。牦牛卵母细胞体外培养24 h后，SRT组的卵裂率与囊胚形成率显著高于INZ组和对照组（P<0.05）；卵母细胞体外培养36 h后，INZ组的卵裂率和囊胚形成率显著低于其他组（P<0.05）。综上表明，SIRT1参与了牦牛卵母细胞的体外成熟，在体外培养液中适当添加SIRT1激动剂，有利于卵母细胞体外成熟及缓解老化，同时改善早期胚胎的发育能力。     

2-氨基乙基联苯基硼酸酯对玻璃化冷冻牛成熟卵母细胞发育能力的影响

【目的】研究内质网IP3受体(IP3R)抑制剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯(2-APB)对玻璃化冷冻-解冻牛MⅡ期卵母细胞发育能力的影响。【方法】将体外成熟24 h的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)用0.1%透明质酸酶消化去除卵丘颗粒细胞,获得的卵母细胞分为对照组和2-APB组,采用OPS法进行玻璃化冷冻,对照组直接进行玻璃化冷冻,2-APB组在玻璃化冷冻前先用10μmol/L 2-APB预处理10 min。2 d后解冻卵母细胞,统计解冻后(0 h)及恢复培养2 h时卵母细胞的存活率,用FITC-PNA荧光探针检测恢复培养2 h时卵母细胞皮质颗粒(CG)的分布,用2′,7′-DCHFDA和Cell Tracker Blue CMF2HC分别检测胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量。将成熟培养24 h未冷冻卵母细胞(Fresh组),与解冻后恢复2 h的对照组和2-APB组卵母细胞同时进行孤雌激活,于培养的第2、7天分别统计孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。【结果】与对照组相比,2-APB组冷冻-解冻卵母细胞0和2 h的存活率均显著增加(P<0.05);2-APB组皮质颗粒皮质区分布比例...     

乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

【目的】研究乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,为研究体内乙草胺对卵母细胞质量的影响提供参考。【方法】将收集的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)置于含有不同浓度(0(对照组)、10、50、100、130、200μmol/L)乙草胺的体外成熟培养液中培养14 h,统计卵母细胞第一极体排出率,进行体外受精后,统计体外受精胚胎的囊胚率,筛选出适宜于卵母细胞体外培养的乙草胺浓度。将COCs在对照组和筛选出的适宜浓度的乙草胺组成熟培养液中培养14 h后,利用DCFH-DA检测卵母细胞活性氧(ROS)水平;利用CellTracker^TM蓝色染料检测卵母细胞谷胱甘肽(GSH)水平;利用JC-1染色法检测卵母细胞线粒体膜电位水平(mitochondrial membrane potential, MMP);利用实时荧光定量PCR检测卵母细胞内凋亡相关基因的表达水平,利用Hoechst 33342染色检测体外受精胚胎的囊胚细胞总数,用Fluorescein-dUTP染色法检测囊胚细胞凋亡率。【结果】与对照组相比,100、130、20...     

Effects of KDM1A on the Meiotic Maturation and Developmental Potential of Yak Oocytes

The purpose of this study was to explore the effects of KDM1A on the meiotic maturation and developmental potential of yak oocytes. The specific inhibitor GSK-KDM1A of KDM1A was added into in vitro maturation medium of yak oocytes. After 24 h in vitro culture of yak cumulus oocyte complexes (COCs), the expansion of cumulus cells and the extrusion of the first polar body were observed. The expression level of KDM1A in oocyte was measured by immunofluorescence during in vitro culture. The expression levels of Kdm1a, Oct-4, Sox-2 and Nanog in oocytes were detected by RT-qPCR. Then, yak oocytes were fertilized after in vitro culture, and the cleavage rate and blastocyst formation rate were observed, respectively. The results showed that the cumulus cells expansion in GSK-KDM1A groups were significant lower than those in control group (P<0.05) after 24 h culture, and the cumulus cells expansion and the first polar body extrusion rate in 320 nmol·L^-1 group were significantly lower than those in 160 nmol·L^-1 group (P<0.05). During oocyte in vitro maturation, Kdm1a showed dynamic expression profile, and the expression level of Kdm1a in MⅠ-stage was significantly lower than that in GV-stage and MⅡ-stage (P<0.05). The GSK-KDM1A could significantly inhibit the expression of KDM1A protein in oocytes (P<0.05), and the expression of KDM1A in 320 nmol·L^-1 group was significantly lower than that in 160 nmol·L^-1 group (P<0.05). The expression levels of Oct-4 and Sox-2 in GSK-KDM1A group were significantly higher than that in control group (P<0.05), but there was no significant difference in the expression of Nanog (P>0.05). After 24 h culture, the cleavage rates of oocytes in GSK-KDM1A groups were significantly lower than those in control group (P<0.05), while the blastocyst formation rate was not significantly different (P<0.05). In conclusion, KDM1A is involved in regulating the meiotic maturation process of yak oocytes. GSK-KDM1A can effectively inhibit the expression of KDM1A, affect the meiotic maturation and developmental potential of oocytes, which reveal that KDM1A plays an important role in this process.     

白藜芦醇对绵羊卵母细胞体外受精的影响

本试验旨在研究不同浓度（0、0.5、2.0、5.0 μmol/L）白藜芦醇（resveratrol,RES）对绵羊卵母细胞体外受精（in vitro fertilization,IVF）、卵母细胞抗氧化能力及卵丘细胞分泌类固醇激素的影响。绵羊卵母细胞在含不同浓度RES的体外成熟（in vitro maturation,IVM）液中培养24 h以后进行体外受精,并收集IVM液,测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）的活性及脂质过氧化产物丙二醛（monochrome display adapter,MDA）的含量;用酶联免疫法测定雌二醇（estradiol,E₂）和孕酮（progesterone,P₄）的浓度。研究结果表明,与对照组相比,在IVM液中添加0.5 μmol/L RES显著提高卵裂率（P<0.05）,但对受精率和囊胚率没有显著影响（P>0.05）;5.0 μmol/L RES显著降低受精率、卵裂率和囊胚率（P<0.05）,对胚胎发育有抑制作用;在IVM和体外培养（in vitro culture,IVC）液中分别添加0.5 μmol/L RES均显著提高受精率、卵裂率和囊胚率（P<0.05）。与对照组相比,在IVM液中添加RES对卵丘细胞分泌E₂有一定的抑制作用,5.0 μmol/L RES显著降低E₂浓度（P<0.05）;0.5 μmol/L RES显著提高卵丘细胞P₄分泌量（P<0.05）。0.5和2.0 μmol/L RES增加SOD和GSH-Px等酶的活性,但与对照组相比无显著差异（P>0.05）,却显著降低MDA含量（P<0.05）;而5.0 μmol/L RES显著降低抗氧化酶活性并增加MDA含量（P<0.05）。综上所述,在IVM和IVC液中同时添加0.5 μmol/L RES,通过增强卵母细胞抗氧化能力和P₄的浓度,并降低MDA含量,从而提高胚胎卵裂率和囊胚率。     

Effects of Resveratrol on in vitro Fertilization of Sheep Oocytes

The purpose of this study was to investigate the effects of resveratrol (RES) at different concentrations (0,0.5,2.0,5.0 μmol/L) on in vitro fertilization (IVF) and antioxidant capacity of ovine oocytes and the secretion of steroid hormones by cumulus cells.Sheep oocytes were fertilized in vitro after maturated in different concentrations of RES for 24 h,and the in vitro maturation (IVM) medium was collected for detecting the enzyme activity of superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-Px) and the content of monochrome display adapter (MDA).The ELISA method was used to detect the concentration of estradiol (E₂) and progesterone (P₄).The results showed that when compared to the control group,adding 0.5 μmol/L RES to the IVM medium significantly increased the cleavage rate (P<0.05),but had no significant effect on the fertilization rate and blastocyst rate (P>0.05);5.0 μmol/L RES significantly reduced the fertilization rate,cleavage rate and blastocyst rate (P<0.05),which had an inhibitory effect on embryonic development.Adding 0.5 μmol/L RES to IVM and IVC (in vitro culture,IVC) medium significantly increased the fertilization rate,cleavage rate and blastocyst rate (P<0.05).Compared to the control group,the addition of RES to IVM solution had a certain inhibitory effect on the secretion of E₂ by cumulus cells,5.0 μmol/L RES significantly reduced E₂ concentration (P<0.05);0.5 μmol/L RES significantly increased the P₄ secretion of cumulus cells (P<0.05).0.5 and 2.0 μmol/L RES increased the activity of SOD,GSH-Px and other enzymes,but there was no significant difference when compared with the control group (P>0.05),but significantly reduced MDA content (P<0.05),while 5.0 μmol/L RES significantly reduced the activity of antioxidant enzymes and increased the content of MDA (P>0.05).In conclusion,0.5 μmol/L RES simultaneously added to IVM and IVC medium could enhance the antioxidant capacity of oocytes and concentration of P₄,and reduced the content of MDA,thus improved the cleavage rate and blastocyst rate.     

G蛋白偶联受体50在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与亚细胞定位研究

试验旨在研究G蛋白偶联受体50（G protein-coupled receptor 50,GPR50）在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与定位规律,为进一步解析卵母细胞成熟的分子机制及理解牦牛繁殖的特异性提供依据。通过牦牛卵母细胞体外成熟培养,利用免疫荧光染色监测不同时间点（0~24 h）纺锤丝形态和核相的变化,确定牦牛卵母细胞减数分裂4个时期,包括生发泡期（germinal vesicle,GV）、生发泡破裂期（germinal vesicle break down,GVBD）、第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ,MⅠ）与第二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ,MⅡ）的时间点。在此基础上,通过实时荧光定量PCR检测GPR50基因在牦牛卵母细胞成熟过程中的动态表达量,免疫荧光染色检测GPR50蛋白在卵母细胞成熟过程中的的亚细胞动态定位情况。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟0 h时90%处于GV期,6 h时94%处于GVBD期,16 h时92%细胞处于MⅠ期,24 h时94%处于MⅡ期。实时荧光定量PCR结果表明,GPR50基因在牦牛卵母细胞GV期即有表达,并在GVBD、MⅠ、MⅡ期成熟过程中逐渐升高,在MⅡ期达到顶峰,且极显著高于GV与GVBD期（P<0.01）。GPR50蛋白在牦牛卵母细胞GV期时集中在膜上表达,并随着成熟进程的发展在细胞质和细胞膜均大量表达,在MⅡ期高亮度弥散表达。以上结果表明,GPR50基因参与牦牛卵母细胞减数分裂过程并发挥重要作用,为研究GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中的作用及机制提供了依据。     

miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响

【目的】研究miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响。【方法】采用Percoll密度梯度离心法获得纯化绵羊精子,将绵羊卵丘-卵母细胞复合体(COCs)在培养箱中培养16～18 h获得成熟卵母细胞,从1月龄纯种萨福克绵羊耳组织分离成纤维细胞,通过实时荧光定量PCR比较绵羊精子、成熟卵母细胞与成纤维细胞中miR-449b的相对表达量;给成熟卵母细胞分别显微注射0.9%生理盐水(Con组)、miR-449b模拟物对照(NC mimic)与miR-449b模拟物(miR-449b mimic),注射后进行孤雌激活,分别于激活的第2、7天统计胚胎卵裂率与囊胚率;将成熟卵母细胞进行体外受精(IVF),收集IVF、Con、NC mimic与miR-449b mimic组2-细胞胚胎,采用免疫荧光法比较组蛋白H3K9me3的变化。【结果】miR-449b在精子中的表达显著高于成熟卵母细胞和成纤维细胞(P<0.05);与Con组相比,miR-449b mimic和NC mimic组胚胎的卵裂率均显著降低(P<0.05),NC mimic组胚胎卵裂率显著低于miR-449b mimic组(P&...