非洲猪瘟病毒pS273R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒（ASFV） pS273R蛋白,并制备其多克隆抗体,为ASFV pS273R的功能研究提供材料。试验通过大肠杆菌表达系统表达重组pS273R蛋白,采用镍亲和层析柱和分子筛纯化重组pS273R蛋白并免疫BALB/c小鼠制备血清,经Protein G琼脂糖树脂纯化鼠抗pS273R蛋白多克隆抗体,通过Western blotting、间接免疫荧光（IFA）和免疫沉淀试验（IP）分析多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示,在16 ℃、1 mmol/L IPTG诱导条件下,pS273R蛋白以可溶形式高效表达,经纯化并免疫小鼠后,通过Protein G可以纯化出高质量的鼠抗pS273R的多克隆抗体。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting、IFA和IP检测到HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-pS273R蛋白和ASFV感染肺泡巨噬细胞（PAMs）中的pS273R蛋白。本研究在大肠杆菌中实现了ASFV pS273R蛋白的高效表达,制备并纯化的抗pS273R多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,这为深入探讨ASFV pS273R蛋白的生物学功能奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。     

非洲猪瘟病毒pK145R蛋白的原核表达及抗血清的制备

为制备兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,本研究以中国首次分离的ASFV HLJ/18毒株K145R基因的真核表达质粒p CAGGS-Flag-K145R为模板扩增K145R基因,构建重组原核表达质粒p ET-21a-K145R,利用镍亲和层析预装柱纯化p K145R蛋白并免疫新西兰大白兔,制备兔抗ASFV pK145R蛋白多克隆抗体,并通过免疫印迹（WB）、间接免疫荧光（IFA）及免疫沉淀（IP）试验对该抗体进行验证。结果显示：本研究成功构建了原核表达质粒p ET-21a-K145R,将该质粒转化细菌BL21(DE3)获得能够可溶性表达p K145R蛋白的重组菌,分子量约为16.0 kDa;利用高度纯化的ASFV pK145R蛋白,制备了兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,该抗体能够特异性地识别HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-K145R蛋白和ASFV感染猪肺泡巨噬细胞中表达的ASFV K145R蛋白。本实验为深入研究p K145R蛋白的功能及其在ASFV感染致病性中的作用奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p37蛋白生物信息学分析及其多克隆抗体制备

【目的】获取ASFV p37蛋白,并制备抗ASFV p37蛋白的多克隆抗体,为ASFV p37蛋白结构和功能研究提供材料。【方法】应用生物信息学工具对ASFV HLJ/2018(GenBank登录号：MK333180.1)p37蛋白进行分析,设计合成p37基因,并构建pET32a-p37重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE对重组蛋白的可溶性进行分析。收集菌体进行超声破碎,分离沉淀并使用8 mol/L尿素变性后离心,用0.45μm滤膜过滤离心后的上清,使用镍亲和层析柱纯化蛋白,通过SDS-PAGE、Western blotting对其纯化效果及特异性进行验证。将纯化后的p37蛋白按照50μg/只免疫小鼠,制备抗ASFV p37蛋白多克隆抗体。利用间接ELISA方法测定制备的多克隆抗体效价;通过Western blotting、间接免疫荧光试验检测该多克隆抗体的特异性。【结果】生物信息学分析表明,p37蛋白为稳定亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(45.28%)、延伸链(15.09%)、无规则卷曲(31...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】 探索猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV） S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】 以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a （+）原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验（IFA）检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】 成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-S重组蛋白的原核表达质粒和在HEK293T细胞中高效表达S1蛋白的真核表达质粒;PEDV-S重组蛋白在IPTG为0.5 mmol/L、16 ℃诱导8 h条件下可获得最高表达量,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,PEDV-S重组蛋白成功表达;ELISA检测结果显示,制备的多克隆抗体效价达1：3 280 500;IFA结果显示,多克隆抗体有良好的特异性,可特异性识别PEDV-S和PEDV-S1蛋白。【结论】 本研究获得了PEDV-S重组蛋白,并成功表达S1蛋白,制备出PEDV-S蛋白多克隆抗体,为研究S蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

试验旨在构建非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）EP153R基因原核表达系统,表达EP153R重组蛋白（rEP153R）,并制备抗rEP153R的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1的EP153R基因序列（GenBank登录号：FR682468.1）合成EP153R基因序列,并将其插入pET-28a载体,构建pET-28a-EP153R重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,分别在16和37 ℃条件下经IPTG诱导12 h进行最适诱导温度筛选。在最适温度下进行重组蛋白的表达,并利用SDS-PAGE、Western blotting进行初步鉴定。切取SDS-PAGE蛋白胶25 ku处条带,利用液相色谱－质谱联用技术鉴定重组蛋白是否正确表达。用纯化的rEP153R免疫小鼠,制备抗rEP153R的多克隆抗体,通过间接ELISA检测其抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果显示,重组菌在16 ℃表达量较高,并以包涵体形式表达,产物在25 ku处出现明显的条带,与预期蛋白大小相符,表明rEP153R成功表达。液相色谱－质谱联用技术鉴定结果显示,匹配到YIGLINK、NESVLLR和KYIGLINK 3个rEP153R的特异性肽段,证实该蛋白为rEP153R。间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶128 000;Western blotting结果显示,制备的抗体具有较好的特异性。以上结果表明本研究成功表达了rEP153R,并制备了其特异性抗体,为进一步研究该蛋白生物学功能、非洲猪瘟活载体疫苗鉴定等提供了技术支持和材料。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及单克隆抗体制备

【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体,通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞;通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型;通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水,使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体,获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株,分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示,6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1∶64 00,7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1∶12 800,且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈...     

非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具...     

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及纯化

【目的】实现A型塞内卡病毒（Seneca virus A,SVA）VP1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立SVA抗体液相芯片技术检测方法。【方法】根据GenBank收录的SVA VP1基因序列（登录号：KY747514.1）,基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成VP1基因,克隆到pCold TF载体,构建重组质粒pCold TF-VP1。将重组质粒pCold TF-VP1转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,进行IPTG诱导表达。通过优化诱导时间及IPTG浓度得出最佳诱导表达条件。采用His标签镍柱纯化VP1重组蛋白,将纯化后的SVA VP1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用Luminex 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度（MFI）,从而判断阴阳性,以用于猪血清中SVA抗体的检测。【结果】重组质粒pCold TF-VP1成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达。经诱导表达在约82 ku处出现阳性条带。当重组菌株诱导条件为16 ℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L、诱导时间为3 h时,VP1蛋白表达量最高;经Western blotting分析,可在82 ku处出现明显条带。将VP1 蛋白与荧光微球偶联,阴性对照（背景）的平均荧光值为17（＜100）。测试孔的平均MFI为2 339.5（＞2 000）,证明SVA VP1蛋白与微球偶联成功,偶联成功的荧光微球可用于检测猪血清中SVA抗体的检测。【结论】本研究在大肠杆菌中成功表达并纯化了SVA VP1蛋白,初步建立了SVA抗体液相芯片检测方法,为后续研究奠定了基础。     

猪丁型冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】表达与纯化猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）的核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白,并制备其多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）。【方法】以PDCoV CHN-HN-1601分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增PDCoV全长的N基因编码序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a（+）中构建重组质粒pET-28a-PDCoV-N。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用0.5 mmol/L IPTG于37 ℃诱导表达12 h。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化N-端和C-端均携带6×His标签的重组N蛋白,并将其免疫新西兰白兔制备抗血清。利用Protein A/G琼脂糖树脂从免疫兔的抗血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）鉴定及抗体效价的间接ELISA测定。【结果】重组PDCoV-N蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为42 ku;上清可溶性N蛋白的纯化纯度可达90%、蛋白浓度为0.45 mg/mL;纯化后的多克隆抗体纯度较高,ELISA方法检测其效价为1∶6 400,能特异性地识别重组N蛋白和PDCoV,与可引起猪腹泻的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PRoV）无交叉反应。【结论】本研究成功制备重组PDCoV-N蛋白及其多克隆抗体,为后续深入研究N蛋白的功能、PDCoV优化血清学检测方法、免疫层析试纸条的制备及开展PDCoV相关基础研究提供参考。     

非洲猪瘟病毒360-12L蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

[目的] 获得抗原性好的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。[方法] 根据GenBank ASFV参考序列（登录号：NC_044959.2）合成360-12L基因,并插入pET-28a（+）载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。[结果] 成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37 ℃ 6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1：512 000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体具有良好的特异性,可特异性识别12L重组蛋白。[结论] 原核表达的12L重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究12L蛋白的生物学功能、ASFV血清学诊断技术和疫苗研究提供生物材料。