过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对NDV和IBDV的杀灭试验

探讨过氧乙酸戊二醛复方消毒剂杀灭新城疫病毒(NDV)和传染性囊病病毒(IBDV)的效果,为鸡病毒性传染病的防治提供依据。分别采用鸡胚接种法、血凝试验和悬浮杀灭试验测定过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对NDV和IBDV的杀灭效果。过氧乙酸戊二醛复方消毒剂灭活NDV、IBDV的有效浓度均为0.04%,最快有效时间分别为10 min和30 min。过氧乙酸戊二醛复方消毒剂可有效杀灭NDV和IBDV。在有效杀灭浓度范围内,随浓度的增高和作用时间的延长对NDV和IBDV的灭活效果增强。     

戊二醛苯扎溴铵溶液对鸡新城疫病毒的杀灭效果研究

考察戊二醛苯扎溴铵溶液消毒剂对新城疫病毒的杀灭效果。参考中华人民共和国农业部《兽用消毒剂技术规范》(1992年版),采用悬浮杀灭试验,以鸡胚感染法,将其通过不同稀释倍数(800、1600、3 200)、在不同时间段(5、10、15、30、60 min)观察其对新城疫病毒的杀灭效果。结果:戊二醛苯扎溴铵溶液在20℃水浴中,1 600倍稀释,作用5min,对鸡新城疫病毒的灭活率在80%以上。结论:戊二醛苯扎溴铵溶液在20℃水浴中,对鸡新城疫病毒的最低有效浓度为1 600倍稀释,该浓度对新城疫病毒的最快有效时间为5 min。     

猪种布鲁氏菌对4种常用新型消毒剂敏感性的研究

为了确定常用新型消毒剂对布鲁氏菌的杀菌/抑菌效果,本研究将聚维酮碘、戊二醛、戊二醛癸甲溴铵复方溶液、二氯异氰尿酸钠4种常用消毒剂与定量B.suis混合均匀,分别作用3 min、10 min与30 min,取0.1 m L涂布于TSA培养基中进行菌落计数;通过对不同消毒剂、不同作用时间其杀菌率的对比,确定不同消毒剂对B.suis的敏感程度。研究表明,B.suis对聚维酮碘溶液敏感性最强,10%聚维酮碘溶液1 000倍稀释作用3 min便能有效杀灭B.suis;其次戊二醛与癸甲溴铵混合溶液效果显著优于戊二醛单独使用,100倍稀释后可有效杀灭B.suis,1 000倍稀释后作用30 min可100%杀灭B.suis;而单独使用戊二醛,仅在10倍稀释时3~30 min能有效杀灭该菌,100倍稀释时作用30 min,其杀菌率仅达93%;而二氯异氰尿酸钠在4种消毒剂中消毒效果最不理想,其最高杀菌率仅为67%;因此,在布鲁氏菌病的防控中,消毒剂以聚维酮碘与戊二醛癸甲溴铵复方制剂为最佳选择。     

戊二醛苯扎溴铵溶液对鸡传染性法氏囊病病毒的杀灭效果

为了考察戊二醛苯扎溴铵溶液消毒剂对鸡传染性法氏囊病病毒的杀灭效果,参考中华人民共和国农业部《兽用消毒剂技术规范》(1992年版),采用悬浮杀灭试验,将其通过不同稀释倍数(50、100、200)、在不同时间段(5、10、15、30、60 min)观察其对鸡传染性法氏囊病病毒的杀灭效果。结果:戊二醛苯扎溴铵溶液在20℃水浴中,100倍稀释,作用60 min,对鸡传染性法氏囊病病毒表现出完全的杀灭效果。表明:戊二醛苯扎溴铵溶液在100倍稀释时鸡传染性法氏囊病病毒的杀灭效果良好。     

牛舍环境中大肠杆菌对常用消毒剂耐药性的研究

为了研究规模化奶牛养殖场空气环境中大肠杆菌对消毒药的耐药性,本试验利用沉降法采集牛舍空气中的细菌样本,应用常规的微生物检验法进行大肠杆菌的分离培养,采用试管稀释法稀释消毒剂对致病性强的大肠杆菌进行敏感性试验。结果显示:从奶牛场空气环境中共分离出30株大肠杆菌,15株具有致病性;血清型鉴定得出O_(78)型7株、O_(101)和O_5型各3株、O_(352)型2株,其中O_(78)型为优势血清型。应用菌毒双杀季铵盐络合碘溶液、癸甲溴铵溶液和聚维酮碘溶液对其进行耐药性试验,数据显示,癸甲溴铵溶液稀释浓度为1:2000时,对大肠杆菌具有较好的抑制效果,1:1500的稀释浓度下5min内可以杀灭;季铵盐络合碘溶液稀释到1:300时才有杀灭作用;聚维酮碘溶液的原液没有杀灭作用。结果表明,此牛场空气环境中的大肠杆菌对季铵盐络合碘溶液和聚维酮碘溶液已经产生耐药性。     

3种常用消毒剂对基因Ⅶ型新城疫病毒的灭活效果

为评价种禽场常用消毒剂对基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)的灭活效果,采用悬液定量法和鸡胚接种试验对癸甲溴铵溶液、聚维酮碘溶液和戊二醛苯扎溴铵溶液3种消毒剂的最低杀毒浓度及其工作液的稳定性进行了研究。在试验条件下,3种消毒剂对基因Ⅶ型NDV均有良好的杀灭效果。癸甲溴铵、聚维酮碘和戊二醛苯扎溴铵溶液杀灭病毒的最低有效浓度分别为25、44.44 mg/L和0.27 mL/L(含戊二醛和苯扎溴铵各约26.67 mg/L)。配制的5 g/L聚维酮碘溶液和0.1 g/L癸甲溴铵溶液消毒工作液完全杀灭病毒的时间分别可保持10 d和135 d,而10 mL/L戊二醛苯扎溴铵溶液则至少可保持180 d。     

新型复合消毒剂——癸甲丙二醇氯铵复合碘实验室抗病毒试验

通过对新型复合消毒剂——癸甲丙二醇氯铵复合碘抗病毒效果的定量试验和定性试验,结果表明,癸甲丙二醇氯铵复合碘（含碘50g／L）按1：500稀释,对猪瘟兔化弱毒和鸡新城疫病毒的灭活率均为100％,对新城疫病毒10min即达到完全灭活作用;按1：1000稀释对猪瘟兔化弱毒、鸡新城疫病毒及牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的灭活率分别为99％、100％和100％,而1：1000稀释的聚维酮碘（含碘50g／L）对照灭活率为90％,癸甲丙二醇氯铵复合碘的抗病毒效果好于聚维酮碘。     

戊二醛苯扎溴铵溶液对H9N2亚型禽流感病毒的灭活效果分析

采用悬浮杀灭试验,考察戊二醛苯扎溴铵溶液对H9N2亚型禽流感病毒的灭活效果。将戊二醛苯扎溴铵溶液通过不同稀释倍数(1 250、2 500、5 000、10 000、20 000)、在不同作用时间(5、10 min)观察其对H9N2亚型禽流感病毒的灭活效果。结果显示,戊二醛苯扎溴铵溶液在10000倍稀释,与H9N2亚型禽流感病毒作用5 min或10 min,灭活率达99.90%以上;在20 000倍稀释,作用5 min或10 min,灭活率均小于99.90%。表明戊二醛苯扎溴铵溶液在10 000倍稀释与H9N2亚型禽流感病毒(20±1)℃水浴作用5 min,即可对H9N2亚型禽流感病毒达到很好的灭活效果。     

2种消毒剂对猪舍自然菌的消毒效果

为了考察戊二醛苯扎溴铵溶液、复方戊二醛溶液2种消毒剂对猪舍自然菌的现场消毒效果,参考中华人民共和国农业部《兽用消毒剂技术规范》(1992年版),采用戊二醛苯扎溴铵溶液100倍稀释、复方戊二醛溶液150倍稀释,通过擦拭法进行消毒前后表面菌落计数,计算杀菌率,判定其现场消毒效果。结果显示:戊二醛苯扎溴铵溶液100倍稀释,复方戊二醛溶液150倍稀释时,与猪舍自然菌作用60 min,杀菌率达96.45%以上。结果表明:2种消毒剂对猪舍自然菌消毒效果相当,戊二醛苯扎溴铵溶液可以推广使用。     

戊二醛和季铵盐复合消毒剂杀菌效果的试验

将金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、溶血性链球菌 C群和类炭疽杆菌实验室培养 ,用 PBS液稀释成 5× 1 0 6 CFU/ m L 细菌悬液或芽胞悬液 ,分别加入到不同浓度的消毒剂作用不同的时间 ,结果表明 :戊二醛和季铵盐复合消毒剂 1∶70 0稀释时 ,1 0 min能有效杀灭金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、溶血性链球菌 ,1∶ 1 0 0稀释时 ,在 5min可杀灭类炭疽芽胞杆菌。用 1 %浓度的消毒剂对鸡场进行现场消毒 ,结果表明 :该消毒剂在60 min可杀灭 99.96%的细菌     

表达禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白的重组耐热新城疫病毒的构建及免疫效果评估

【目的】 研究针对新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)的耐热基因工程疫苗。【方法】 利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株的HN基因替换到LaSota疫苗株上, 再将禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)的Fiber2基因插入到其基因组上, 构建表达Fiber2蛋白的重组耐热NDV质粒pTS-HN-Fiber2。通过病毒拯救技术拯救重组NDV rTS-HN-Fiber2, 并测定其生物学特性和作为疫苗候选株的免疫原性和攻毒保护性。【结果】 rTS-HN-Fiber2的鸡胚平均致死时间>168 h, 且脑内接种致病指数为0, 属于弱毒的范畴; 在细胞上的生长曲线结果表明, rTS-HN-Fiber2与亲本LaSota株有相似的生长曲线, 但最终的生长滴度略低于LaSota株; rTS-HN-Fiber2在56 ℃处理15 min后, 病毒滴度下降约10³ TCID₅₀/mL, 而LaSota株56 ℃处理5 min几乎无感染性; 间接免疫荧光试验结果表明, rTS-HN-Fiber2能表达Fiber2蛋白。免疫和攻毒试验结果显示, rTS-HN-Fiber2能产生NDV抗体, 且能显著提高雏鸡在FAdV-4强毒下的存活率, 减轻FAdV-4强毒引起的组织病变, 降低组织中的病毒载量。【结论】 本研究成功构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV, 该病毒保持了亲本LaSota株的弱毒生物学特性, 但热稳定性有显著提升; 重组NDV免疫雏鸡可产生针对NDV和FAdV-4强毒的保护, 该重组NDV可作为开发针对FAdV-4和NDV二联基因工程疫苗的候选病毒株。     

基于F和HN蛋白的基因Ⅶ型新城疫病毒嵌合疫苗的构建及免疫效力评估

【目的】试验旨在构建一种基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)嵌合疫苗,并对其免疫效力进行评估。【方法】利用反向遗传学技术,以含有禽偏禽腮腺炎病毒2型(Avian metaavulavirus-2,AMAV-2)Y2株基因组的重组质粒pT7-Y2为模板,将Y2株的F和HN蛋白的胞外区替换为基因Ⅶ型NDV HB0901株的F和HN蛋白的胞外区,将HB0901株的F蛋白裂解位点突变为LaSota弱毒株的F蛋白裂解位点,构建嵌合重组病毒rY2-FHNR株。对rY2-FHNR株的增殖特性、致病力及遗传稳定性等生物学特性进行检测,并通过接种2周龄SPF鸡评估rY2-FHNR株的免疫原性及其免疫血清与Y2株的交叉反应性,利用NDV NP蛋白的间接ELISA方法对免疫血清进行检测,验证其鉴别诊断效果。【结果】试验成功获得了嵌合重组病毒rY2-FHNR株,生物学特性检测结果显示,rY2-FHNR株在鸡胚中的增殖滴度和致病性符合弱毒特征,其鸡胚传代的遗传稳定性良好。rY2-FHNR株可诱导机体产生针对NDV的抗体,且免疫血清不与rY2株抗原发生交叉反应。通过NDV...     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID₅₀绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID₅₀、鸡胚半数感染量(EID₅₀)与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^6.375 EID₅₀,细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID₅₀值为10^7.0/0.1 mL,EID₅₀为10^7.5/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

薄层色谱法分离鉴别复方季铵盐戊二醛溶液中的季铵盐

建立了复方季铵盐戊二醛溶液中季铵盐分离鉴别方法,即以[氯仿-水（20∶1.5）的下层溶液]-甲醇（10∶3）为展开剂、浓氨试液为预平衡剂,采用硅胶G薄层板进行分离鉴别,实现了三类季铵盐良好的分离鉴别,并且较好的避免了制剂中其他辅料的干扰。该方法操作简便、成本低廉、分离效果良好,适用于该类复方消毒剂的质量控制。     

羊口疮病毒PMA-PCR检测方法的建立

【目的】 为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)是否失活,本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)联合PCR扩增技术,以F1L基因为靶向检测对象,旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-PCR检测方法。【方法】 将病毒悬液经不同温度相同时间的水浴处理,通过PCR确定病毒样本最佳的热灭活温度;分别设置PMA曝光时间梯度及浓度梯度,进一步对PMA的曝光时间和工作浓度等因素进行优化,确定有效区分具有感染活性OrfV和失活OrfV的PMA最佳处理条件;对所建立PMA-PCR方法进行特异性试验验证,并通过对不同数量比例的热灭活OrfV、活OrfV混合病毒悬液样本进行检测来验证该方法的敏感性。【结果】 OrfV样本经60 ℃热水浴处理10 min即可被完全灭活;PMA与失活OrfV的DNA共价结合且溶液中游离PMA光解的最佳曝光时间为15 min;热灭活OrfV基因组扩增被完全抑制的最小PMA浓度为20 μmol/L,活OrfV基因组扩增不受抑制的最大PMA浓度为35 μmol/L;特异性试验结果表明,该方法检测活OrfV时出现阳性条带,而口蹄疫病毒(FMDV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)的扩增结果均呈阴性;经PMA处理后,在不同数量比例的活、热灭活OrfV病毒悬液中检测到活OrfV的灵敏度为10^-1.68 TCID₅₀/0.1 mL。【结论】 本试验成功建立了针对活OrfV的PMA-PCR检测技术,该方法特异性强、敏感度高,可为相关工作领域评估OrfV致病性提供技术参考。     

Disinfectant susceptibility testing of avian and swine Campylobacter isolates by a filtration method

The susceptibility testing of disinfectants against Campylobacter jejuni and Campylobacter coli strains from broilers and pigs was investigated. The filtration method European standard EN 1040 was adapted to Campylobacter cultures and validated with reference strains. Two disinfectants were tested: 1% benzalkonium chloride active matter, as quaternary ammonium compound, and 0.63% sodium hypochlorite as chlorine-releasing agent. Both disinfectants were effective against the 34 Campylobacter strains tested after 5 min exposure under in vitro conditions. No link between resistance to disinfectants and antibiotics could be observed.     

苯扎溴铵－大蒜素复方消毒剂的杀菌效果试验

为了探明苯扎溴铵－大蒜素复方消毒剂的杀菌效果,根据兽用消毒剂鉴定技术规范的相关规定,用不同稀释倍数(500、1000、2000、4000倍)的该消毒剂在不同时间段(1、5、10、20 min)对5种细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性链球菌C型及蜡样芽孢杆菌)进行杀菌效果试验,同时以苯扎溴铵和大蒜油为对照试验组,观察和评价苯扎溴铵－大蒜素复方消毒剂的杀菌效果。结果表明在2000倍稀释的状态下该复方消毒剂对以上5种细菌表现出了完全的杀菌效果。因此,苯扎溴铵－大蒜素复方消毒剂在2000倍的稀释状态下能达到良好的杀菌效果,便于临床应用。     

新城疫病毒HeB02分离株F基因的序列分析

根据国外已发表的新城疫病毒F基因序列，设计了1对引物，并以RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒HeB02分离株的F基因，基因产物大小为1．63kb，与设计相符。对其进行序列测定后，与其他标准毒株F48E9、LaSota和Clone30的F基因进行了同源性比较，结果表明，HeB02株与国内标准强毒株F48E9及目前广泛应用的弱毒疫苗株LaSota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88.1％、84.9％和83.8％。由此可以看出，HeB02分离株与标准毒株和疫苗株相比，在F基因上发生了变导。     

Isolation and biological properties of virulent subpopulations from lentogenic Newcastle disease virus strains

From each of two lentogenic Newcastle disease virus (NDV) strains of the type LaSota and Hitchner B1 a virulent subpopulation could be obtained. The two subpopulations were—in comparison to the two parent viruses—more resistant to the lipid solvent chloroform and more stable against thermal degradation. Also, the glycoproteins haemagglutinin and F (fusion) were more stable against thermal inactivation. Electron microscopic observations revealed in terms of size and morphology all of the characteristics of NDV. Both subpopulations possessed, however, the same elution kinetics as their respective parent strains. The intracerebral and intravenous pathogenicity indices as well as the mean death times of the two subpopulations allow to classify these viruses as virulent Newcastle disease viruses.     

纳米银体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

【目的】 研究纳米银（silver nanoparticles,AgNPs）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】 使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数（multiplicity of infection,MOI） PRRSV （0.0001~0.1）黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】 AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5 μg/mL,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间（3、6、12、18、24 h）加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】 AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。