猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP3-GP5-M融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业发展的传染病,为了PRRSV GP3-GP5(N-糖基化蛋白)-M(膜蛋白)融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性,本研究利用脂质体法将构建好的真核重组表达质粒pcDNA3.1-ORF3-ORF5-ORF6转染猪肾细胞(PK-15细胞),经G418(600 μg/mL)筛选(72 h)获得稳定表达PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白的稳定细胞株.以RT-PCR分析目的基因转录;间接免疫荧光检测融合蛋白表达;Western blot和小鼠(Mus musculus)免疫试验检测融合蛋白免疫原性.结果表明,RT-PCR检测到3种目的基因的转录;间接免疫荧光检测到融合蛋白得以表达,Western blot检测到融合蛋白可与阳性猪血清发生特异性反应.小鼠免疫试验二免后S/P=样本/阳性对照的比率,达到1.80(S/P＞0.4为阳性),并且至少可以持续1个月.本研究成功实现了PRRSV GP3-GP5-M 融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达,证实PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白具有良好的免疫原性,为PRRSV 多基因核酸疫苗研制提供了基础资料.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） BJ-4株ORF2基因的原核表达

通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF2扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF2(deleting ORF2)。将dORF2克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21细胞中成功地表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组蛋白GST-dORF2，表达量为22％。Westem-blot结果表明重组蛋白可被谷胱甘肽S-转移酶(GST)抗体识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV次要结构蛋白的结构和功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的融合表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)ORF5基因的核苷酸序列设计3对特异性引物，从重组质粒pMD- ORF5中扩增去除ORF5基因中包括全部信号肽在内的N端跨膜区(28 residues)和中部跨膜区(60 residues)。改造后的ORF5基因分别命名为ORF5-1和 ORF5-2。将2个基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析，ORF5-1和ORF5-2基因获得融合表达，表达量分别为12.2%和39%，证明删除双跨膜区能明显提高ORF5基因的表达量。经Western blot分析，融合蛋白具有一定的免疫学活性，表明摘除跨膜区对该蛋白的抗原性影响不大。     

用噬菌体随机肽库分析猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） N蛋白单克隆抗体识别的表位

利用噬菌体随机7肽库分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白B细胞抗原表位。以PRRSV BJ-4株N蛋白的单克隆抗体(mAb)GE3作为筛选分子，筛选噬菌体展示的随机7肽库。经序列测定和分子生物学软件分析，表明噬菌体展示的外源氨基酸序列与PRRSV BJ-4株N蛋白的50～55aa的氨基酸序列有极高的同源性。ELISA分析结果表明，筛选到的噬菌体能特异性地与PRRSV阳性血清结合，从而证实了该表位是单克隆抗体GE3所识别的抗原表位。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异分析

从河北、江西猪场中分离到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HB-1(sh)／2002、HB-2(sh)／2002和JX-1／2002)。采用RT-PCR方法扩增其完整的ORF5基因片段，进行了序列测定，并与其它5个国内毒株的ORF5基因序列进行了比较和变异分析。所有这些毒株的ORF5基因均编码200个氨基酸，推导的氨基酸相似性在88．2％～99．0％之间。其中BJ4、S1及J1间的相似性较高，在98％～99％之间；HB-1(sh)／2002，HB-2(sh)／2002，JX-1／2002及CH-1a间的相似性为92％～96％之间。根据ORF5基因核苷酸序列的遗传进化距离，这些毒株可分为两个亚群，BJ4、S1和J1为一个亚群，与VR2332及疫苗毒株接近；HB-1(sh)／2002、HB-2(sh)／2002、JX-1／2002和CH-1a为另一个亚群。     

表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株全长cDNA的构建

依据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ-4株全基因组序列，分6段设计引物A1F／A1R、A2F／A2R、B1F／B1R、B2F／B2R、C1F／C1R和D1F／D1R，应用RT-PCR技术扩增出其全基因组cDNA片段。将各cDNA重叠片段AJ、A2、BI、B2、C和D分别克隆入pGEM-T Easy载体后，依次连接并克隆到低拷贝质粒载体pWSK29，获得该毒株全长cDNA克隆pWSK DCBA。为进一步研究该毒株的感染性cDNA克隆和深入研究PRRSV的分子致病机理以及发展安全有效的活病毒疫苗奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NB/04株全基因组分子特征分析

对猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome viurs, PRRSV）分离株NB/04的全基因组序列测定与分析。该毒株基因组全长15408bp,包含9个开放式阅读框,5’Untranslating Region(UTR)含有189nt,3’UTR含有150nt,其中包含28个Poly（A）。基因组序列分析结果表明,该毒株的Nsp2存在3个核苷酸缺失,3’UTR缺失一碱基。通过与国内外美洲型PRRSV分离株比对分析可知,非结构蛋白区的Nsp2和结构蛋白区的ORF5变异率最大。特别是Nsp2与国内主要分离株的氨基酸相似性在79.3%-96.4之间,ORF5与国内主要分离株的相似性介于86.1%-95.5%。依据Nsp2的推导氨基酸序列进行的系统进化分析可知,NB/04属于北美洲基因型,与BJ-4属于同一分支,而与中国标准株Ch-1a分属于不同的分支,表明浙江PRRSV已发生较大的变异。本研究结果丰富了我国PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传变异与生物学特性之间的关系奠定了基础。     

核酸探针检测人工感染猪及死胎的猪繁殖与呼吸综合症病毒

利用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合症病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲株ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ。将ＰＣＲ产物连接进线状克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ后获阳性重组质粒。用ＥｃｏＲＩ及ＳｍａＩ双酶切阳性重组质粒ＤＮＡ,回收４６３ｂｐ的小片段并以此制备出地高辛标记的核酸探针。应用该探针对４头鼻内人工感染ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的     

猪繁殖与呼吸综合征流行病学概述

猪繁殖与呼吸综合征（porcinere productive and resp iratory syndrome,PRRS）俗称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状以及断奶仔猪高死亡率为特征的病毒性传染病,国际动物卫生组织（0IE）将该病列为B类传染病,我国也将其列为二类传染病。由于猪繁殖与呼吸综合征病毒容易发生抗原变异引起毒力加强,主要靶细胞为具有免疫作用的肺泡巨噬细胞,     

PRRSV GP5和M蛋白重组腺病毒对猪的安全性和免疫效力

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5 重组腺病毒(recombinant Adenovirus-GP5,rAd-GP5)和M蛋白重组腺病毒(rAd‐M)分别接种4只30日龄PRRSV阴性断奶健康仔猪，结果为仔猪接种后2周内体温和食欲正常，猪血液、鼻塞、粪便和猪舍环境中重组腺病毒及其野生型腺病毒检测均为阴性。同时，将rAd‐GP5、rAd-M、rAd-GP5+M (rAd-GP5和rAd-M,V/V=1)和PRRSV-Resp弱毒株分别接种4只30日龄PRRSV阴性仔猪，不同时间检测PRRSV抗体，结果为免疫后14和45 d可检出PRRSV ELISA抗体和中和抗体；免疫后60～90 d，rAd-GP5和rAd-M免疫组ELISA抗体滴度均达1∶2400以上，与PRRSV‐Resp弱毒免疫组相似，而中和抗体滴度达1∶6以上，低于PRRSV-Resp弱毒免疫组；rAd-M免疫组ELISA抗体和中和抗体滴度则低于rAd‐GP5免疫组。rAd-GP5和rAd-M混合免疫组ELISA抗体达1∶4800,其中和抗体滴度与其单独免疫组相似。15只仔猪免疫后28 d进行攻毒保护试验，结果为重组腺病毒免疫猪攻毒后3 d平均体温为39.5℃,病毒血症和排毒时间仅为2周，与PRRSV-Resp弱毒免疫组相似，而空白对照组病毒血症和排毒时间至少60 d。攻毒后7～14 d，rAd-GP5和rAd‐M免疫组ELISA抗体和中和抗体水平明显升高。研究表明rAd-GP5和rAd-M重组腺病毒具有较好的安全性，均可诱导猪体产生较好的免疫反应，两者具有明显的协同免疫作用。