卵丘细胞与卵母细胞解离对小鼠卵子体外成熟及受精的影响

卵丘细胞与卵母细胞的解离会降低小鼠卵母细胞的成熟质量,该研究将解离所得裸卵用不同种成分明确的成熟培养液进行体外成熟、体外受精、体外发育,从而确定卵丘细胞与卵母细胞的解离对小鼠卵母细胞成熟、受精、发育的影响,并通过筛选建立起最优的试验体系,为去除卵丘细胞的卵母细胞体外成熟质量的提高及后续研究提供参考依据。结果显示,裸卵的成熟率与成熟培养液的选择密切相关,TYH组、HTF组极显著优于M199组、α-MEM组;卵丘细胞与卵母细胞的解离与否对受精率的影响是巨大的,解离后(10%～28%)与解离前(48%～76%)差异极为显著(P<0.01);卵丘细胞与卵母细胞的解离与否对发育率的影响未发现显著差别(P>0.05)。因此,卵丘细胞与卵母细胞的解离主要影响了小鼠卵母细胞的体外受精率,通过选用适当的培养液可以相对改善该情况。     

昆明小鼠早期胚胎发育时程

以昆明种小鼠为对象,在严格控光条件下,对交配后阴道栓形成时间、排卵时间、精子入卵与原核形成时间以及2-细胞至囊胚的发育时程等进行了系统研究。结果如下:(1)从注射hCG 当天(0 d)21:00(hCG后6 h)至次日(第1 天)1:00(hCG 后10 h),有84.2% 的超排小鼠形成阴道栓;(2)大部分小鼠(66% ～100% )排卵从hCG后第1 天2:00(hCG 后11 h)开始,至3:00～4:00(hCG后12～13 h)结束;(3)从hCG 后第1 天7:00(hCG后16 h)至11:00(hCG 后20 h),小鼠卵受精率为5.6% ～82.4% ;(4)从hCG后第1 天7:00(hCG 后16 h)至11:00(hCG 后20 h),原核形成率为4.4% ～67.5% ;(5)从hCG 后第1 天21:00(hCG 后30 h)至第2 天1:00(hCG后34 h),2-细胞形成率为14.9% ～83.1% ;hCG后第2 天19:00(hCG后52 h)至23:00(hCG后56 h),4-细胞形成率为12.9% ～85.7% ;hCG 后第3 天6:00(hCG后63 h)至10:00(hCG 后67 h),8-细胞形率为12.8% ～88.2% ;(6)从hCG 后第3 天10:00(hCG 后67 h)至24:00(hCG后81 h),8～16 细胞(早期桑葚胚)形成率由100% 下降到42.9% ;从hCG 后第3 天24:00(hCG 后81 h)至第4 天4:00(hCG后85 h),17～32 细胞(晚期桑葚胚)形成率由57.1% 增加到90.0% ;(7)从hCG 后第4 天6:00(hCG后87 h)至8:00(hCG后89 h),囊胚形成率从11.4% 上升到60.9% 。     

绵羊卵丘细胞对裸卵体外成熟及孤雌发育影响的研究

本研究探讨绵羊卵丘细胞对裸卵体外成熟和后期发育的影响。实验分为4组,对照组为卵丘-卵母细胞复合体(COCs);裸卵(DO)组;COCs与DO共培养组(CODO);卵丘细胞(CC)与DO共培养组(CCDO)。体外成熟培养18 h后,检测各组卵子成熟质量并进行孤雌发育研究。结果表明:CODO和CCDO组中裸卵活率显著高于DO组(P<0.05),但显著低于COCs组(P<0.05),且COCs组中卵子活率极显著高于DO组(P<0.01);在极体排出率方面,CODO、CCDO和DO3组差异不显著(P>0.05),但是它们都显著低于COCs组(P<0.05)。COCs、CODO、CCDO和DO 4组卵裂率差异均不显著(P>0.05)。然而,DO组的囊胚率显著低于CODO和CCDO组(P<0.05),极显著低于COCs组(P<0.01),但CODO和CCDO 2组中裸卵的囊胚率差异不显著(P>0.05)。总之,无论散在的卵丘细胞还是COCs均能提高裸卵体外成熟及后期发育潜力。     

牛卵丘细胞对卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

试验以牛卵泡内卵丘-卵母细胞复合体(COCs)为材料,探讨了牛卵丘细胞包裹程度对卵母细胞体外成熟(IVM)和孤雌胚胎(PAEs)发育的影响。试验1,将COCs随机分为2组,在开展IVM前,将其中一组COCs的卵丘细胞机械吹打去除成为机械裸卵(DOs),研究卵丘细胞层存在与否对卵母细胞体外核成熟(排出第一极体)和孤雌激活后发育能力的影响;试验2,根据COCs卵丘细胞包裹层数将COCs分为3组,即卵丘细胞层少(1～4层)的COCs为A组、卵丘细胞层多(5层以上)的COCs为B组及包裹5层以上卵丘细胞且附带卵泡壁颗粒细胞层(FSP)的COCs为C组,研究卵丘细胞层包裹程度对卵母细胞的体外核成熟和孤雌激活后胚胎发育能力的影响。结果表明:卵丘细胞的存在更有利于卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育;COCs中卵丘细胞包裹层数对卵母细胞体外核成熟率没有显著影响,但包裹卵丘细胞层数多且附带FSP的卵母细胞,其PAEs的囊胚率显著高于包裹卵丘细胞少的卵母细胞PAEs。     

E-钙粘蛋白抗体对小鼠早期胚胎发育的影响

旨在研究E-钙粘蛋白抗体(ECCD-1)对小鼠早期胚胎体内外发育的影响.在体外培养小鼠8-细胞胚胎的培养液中,分别添加不同浓度的ECCD-1,通过胚胎形态观察、碱性磷酸酶染色、多能性因子免疫染色、体外贴壁培养、嵌合体制备以及体内移植试验检测ECCD-1对小鼠胚胎发育能力的影响.结果表明,ECCD-1抗体延迟胚胎致密化和囊胚腔形成,但内细胞团并未受到影响,胚胎碱性磷酸酶和SSEA-1、Oct-4、Sox2、Nanog 4种多能性因子的免疫染色都呈阳性,此外,ECCD-1抗体也不影响胚胎的体外贴壁生长、体内移植着床以及嵌合体的制备.这些数据表明,ECCD-1抗体延迟胚胎致密化但并不影响胚胎的体内外发育能力.     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素（AX）对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23~25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50 μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10 μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率（P<0.05）;显著提高囊胚的细胞数（P<0.05）;极显著提高TGF-β基因表达量（P<0.01）。结果表明,添加10 μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。     

卵丘细胞对卵母细胞成熟、受精和胚胎发育的影响试验

将从猪卵巢上获取的卵母细胞根据卵丘细胞层数的多少分为两类,并将这两类卵母细胞进行成熟培养、体外受精和孤雌激活,以验证两类卵母细胞的发育潜能.结果显示,将两类卵母细胞分别进行成熟培养时,优级卵的成熟率高于次级卵（67.42±177;1.52％vs 48.33±177;2.85％）,且差异极显著（P＜0.01）;将成熟的卵母细胞进行孤雌激活后,优级卵的囊胚率高于次级卵（58.00±177;2.88％ vs 41.00±177;6.40％）,且差异极显著（P＜0.01）,但囊胚总细胞教两者无显著差异（P＞0.05）;将成熟的卵母细胞进行体外受精后,优级卵的囊胚率、囊胚总细胞数均高于次级卵（18.00土5.70％ vs 4.25±177;2.31％,41.7±177;3.33 vs 36.2土2.10）,且差异极显著（P＜0.01）;进行受精卵孵育时,未去除卵丘细胞的胚胎卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均高于去除卵丘细胞的（88.14土7.48％ vs 58.69±177;2.89％,51.2±177;7.33％ vs 11.92±177;2.29％,41.7±177;3.33 vs 36.8±177;3.15）,且差异极显著（P＜0.01）.以上结果说明：卵丘细胞层数较多的卵母细胞成熟率高,且其孤雌和体外受精胚胎的发育潜能也好;卵丘细胞存在时,有助于卵母细胞的受精及以后的胚胎发育.     

半胱胺对牛卵母细胞早期胚胎发育能力的影响

半胱胺（Cysteamine）是一种重要的巯基物,在体外培养体系中添加半胱胺能够增强谷胱甘肽（GSH）的合成和胚胎发育能力。本研究旨在探讨不同浓度半胱胺处理对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育能力的影响。结果表明,在牛卵母细胞体外成熟液中添加100μM的半胱胺,其囊胚率与对照组有显著差异;但是,与同时在成熟液和发育液中都添加100μM的半胱胺组差异不显著。研究结果也表明,在牛卵母细胞体外成熟培养液中添加半胱胺会提高牛卵母细胞的囊胚发育率,而且随着浓度的增加这种作用将达到饱和,其最佳作用浓度为100μM。     

组织蛋白酶对成年绵羊卵母细胞体外发育能力的影响

本研究旨在观察绵羊卵丘细胞中组织蛋白酶( CTSS、CTSB)的mRNA在体外成熟过程中的表达规律,探明卵丘细胞中组织蛋白酶( CTSS、CTSB) mRNA的表达与卵母细胞体外发育能力之间的相关性.采用Real-time PCR方法检测绵羊在体外成熟0、8、16和24 h的卵丘细胞中组织蛋白酶(CTSB、CTSS)的mRNA表达水平,以及在成熟液中添加组织蛋白酶抑制剂(E-64)后卵丘细胞中CTSB和CTSS的mRNA表达量在体外成熟前及体外成熟后的表达水平,并测定在成熟液中添加1、5、10 μmol·L-1 E-64对卵母细胞成熟率、受精率及囊胚发育率的影响.结果,卵丘细胞中的CTSS和CTSB mRNA表达均随着体外成熟时间的增加(IVM 0 h、IVM 8 h和IVM 16 h)呈下降的趋势(P＜0.01).添加5和10 μmol· L-1 E-64组的卵丘细胞中CTSS和CTSB mRNA表达水平较对照组和1 μmol· L-1组均显著性降低(P＜0.01),而5和10μmol·L-1组间的CTSS和CTSB mRNA表达水平无显著差异(P＞0.05).成熟液中添加5和10 μmol·L-1的E-64组的囊胚发育率(26.82％和30.95％)显著高于1 μmol· L-1组和对照组(18.23％和15.63％,P＜0.05),但5和10 μmol·L-1组对卵母细胞的成熟率及卵裂率与1 μmol· L-1组和对照组间无显著性差异(P＞0.05).结果表明,绵羊卵丘细胞中CTSS和CTSB的mRNA表达水平在体外成熟过程中呈下降趋势,其mRNA表达水平与胚胎的发育能力呈负相关;组织蛋白酶特异性抑制剂E-64可下调绵羊卵丘细胞中CTSS和CTSB的mRNA表达水平,并提高卵母细胞随后的体外发育能力.     

罗同丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟及其后续发育的影响

观察了卵丘细胞共培养对小鼠生发泡期部分裸露（PNO）和裸卵（NO）成熟和发育能力的影响；分别用小鼠、大鼠、猪的卵丘细胞与小鼠PNO和NO进行了共培养。检测了小鼠PNO和NO的减数分裂能力、生发泡构型、受精和胚胎发育能力。结果，PNO、NO的减数分裂能力显著（P〈0．05）低于卵丘完整复合体（COCs）的减数分裂能力。COCs中SN型卵母细胞比率显著高于PNO和NO中SN型卵母细胞比率（P〈0．05），大部分PNO和NO的卵母细胞核型为NSN型。与对照组相比，与小鼠或大鼠卵丘细胞共培养的小鼠PNO和NO的减数分裂能力没有显著提高，但是与猪卵丘细胞共培养却可以提高小鼠PNO和NO的减数分裂能力。结果表明，猪卵丘细胞能促进小鼠卵母细胞的体外成熟，但并不影响小鼠卵母细胞的受精和胚胎发育。     

Factors Affecting the Development of Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos in Cattle

Nuclear transfer is a complex multistep procedure that includes oocyte maturation, cell cycle synchronization of donor cells, enucleation, cell fusion, oocyte activation and embryo culture. Therefore, many factors are believed to contribute to the success of embryo development following nuclear transfer. Numerous attempts to improve cloning efficiency have been conducted since the birth of the first sheep by somatic cell nuclear transfer. However, the efficiency of somatic cell cloning has remained low, and applications have been limited. In this review, we discuss some of the factors that affect the developmental ability of somatic cell nuclear transfer embryos in cattle.     

昆明小鼠早期胚胎体外发育阻滞原因分析

为了分析小鼠早期胚胎在体外发育阻滞的原因 ,建立早期胚胎体外培养系统 ,应用几种不同的培养系统对昆明小鼠单细胞胚胎在体外培养了 96～ 12 0 h。结果表明 ,小鼠单细胞胚胎在 M1 6 和 BWW培养液中卵裂均受到阻滞 ,且两者之间差异不显著 (P>0 .0 5 ) ;CZB和 HTF培养液能有效地克服小鼠胚胎的 2 -细胞发育阻滞 ,与 M1 6 和 BWW相比 ,2 -细胞卵裂率和囊胚率均存在显著性差异 (P<0 .0 1) ;在 M1 6 培养液中添加牛磺酸对早期胚胎发育有促进作用 (P<0 .0 1) ;小鼠早期胚胎在 CZB和牛输卵管上皮细胞 (COEC)共培养体系中的卵裂率较对照组明显提高 (P<0 .0 5 )     

苜蓿体细胞胚发生的影响因素

在组织培养过程中诱导苜蓿体细胞胚发生的关键因素有两个：一是植物材料，包括基因型和外植体类型；二是培养基成分。研究结果认为：紫花苜蓿体细胞胚发生能力较强，无菌苗子叶和下胚轴是发生率较高的外植体；2．0mg／L的2,4-D补加适宜浓度的NAA、KT和BA等激素是相对平衡的激素组合，也是必需的。添加一些有机物有利于提高体细胞胚发生率。     

3种中药有效成分对小鼠胚胎体外发育的影响

以mCZB添加抗生素为对照组,以分别添加0.1 mg/L小檗碱(berberine,BR)、0.5 mg/L川芎嗪(ligustrazine,Lig)和4 mg/L黄芩苷(baicalin,Bai)为试验组,比较各组胚胎孵化率、微滴中一氧化氮(Nitric oxide,NO)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及孵化胚胎的细胞数量,从而探讨中药有效成分对小鼠早期胚胎体外发育的影响。结果显示,Bai组(80.2%,81.3%)、Lig组(78.9%,77.6%)及BR组(76.7%,71.6%)胚胎孵化率极显著高于对照组(50.7%、47.8%)(P<0.01)。各组间NO含量,72 h较24 h均有减少,而120 h又均有增加且最高。各组间MDA含量,72 h和120 h与24 h比较呈现增加趋势,除Bai组120 h外,对照组均高于试验组。孵化胚胎细胞计数结果显示,BR组(87.2±8.6)、Lig组(83.9±7.7)和Bai组(81.9±6.2)与对照组(77.4±5.6)差异极显著(P<0.01)。结果表明:3种中药有效成分均能促进小鼠早期胚胎的体外发育及胚胎细胞增殖,并对NO和MDA含量有一定影响。     

家兔显微受精影响因素及显微受精胚胎超微结构

以家兔为实验动物，利用胞质内精子注射技术和透明带下精子注射技术，对卵龄、精子获能、注射针管口径、操作室温和操作方法等影响显微受精的因素以及显微受精胚胎的超微结构进行了研究。结果显示：（１）胞质内单精子注射，ｈＣＧ后１５－１７ｈ卵的存活率为６９．４％，显著（Ｐ〈０．０５）高于ｈＣＧ后１９－２１ｈ卵的存活率（４７．３％）；而受精率和卵裂率（分别为５２．９％和４１．２％）分别低于ｈＣＧ后１９－２１ｈ卵的     

牛体外受精冷冻胚胎移植妊娠率影响因素的研究

选用不同品种母牛作为试验动物，试验在排除胚胎质量和胚胎移植人员技术水平对胚胎移植影响的前提下，分别对不同品种、不同管理方式、不同营养水平、不同外源激素对牛体外受精冷冻胚胎移植妊娠率的影响进行研究，同时通过测定内源激素水平来验证黄体触诊法在实际胚胎移植工作中的可行性。结果为：①不同品种受体母牛对体外受精冷冻胚胎移植妊娠率没有显著影响；②不同管理方式、营养水平以及注射亚硒酸钠维生素E对体外受精冷冻胚胎移植妊娠率没有显著差异，但都有所提高；③注射外源激素对体外受精冷冻胚胎移植妊娠率没有显著影响。     

影响绵羊冻胚移植妊娠率的因素分析

本研究对胚胎质量、胚胎移植数量、胚胎发育阶段、冷冻方法、移植方法及饲养管理水平等因素对移植产羔率的影响进行研究,以提高绵羊胚胎移植效率。结果表明:采用1.5mol/L乙二醇做冷冻保护剂对胚胎进行常规冷冻,冻前A级胚胎冷冻/解冻后可用胚率、存活率、降级率均高于B级,差异极显著(P<0.01)。移植1枚冷冻解冻后A级、B级或2枚(A+B)胚胎的受体移植产羔率分别为44.48%、46.84%和44.81%。经χ2检验分析,三者之间无显著差异(P>0.05)。移植双胚的受体双羔率为22(%53/241),以胚胎为单位计算,产羔率仅为33.40%。A级囊胚和桑椹胚的产羔率之间无显著差异(P>0.05)。1.5 mol/L乙二醇常规冷冻保存的体内胚胎移植产羔率高于EFS40玻璃化冷冻保存,但经统计学分析,二者无显著差异(P>0.05)。子宫手术移植和腹腔内窥镜法子宫移植之间产羔率不具统计学差异(P>0.05)。在牧场条件下大规模移植的平均产羔率为43.95%,范围在20%￣70%之间,受体饲养管理水平对绵羊移植产羔率有较大影响。     

影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素

试验对影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素进行探讨，以找出理想的玻璃化冷冻方法。在测试的５种玻璃化溶液中，含３５％乙二醇（ＥＧ）和１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的溶液（ＶＳ１）对胚胎的毒性最小。用ＶＳ１冷冻桑椹胚和囊胚的理想程序是：在室温下使胚胎分别在２０％ＥＧ和３５％ＥＧ中平衡２、３分钟后，移入ＶＳ１中，０．５分钟内（囊胚也可在２分钟后）投入液氮中冷冻。桑椹胚的存活率为９１．７％（３３／３６），囊胚的存活率为９７．１％（３３／３４）～９７．３％（３６／３７）。８～１６细胞胚胎的理想冷冻程序为：在室温下使胚胎在２０％ＥＧ、３５％ＥＧ中平衡２、３分钟，移入４℃的３７％ＥＧ＋１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中平衡２分或１０分钟后冷冻，胚胎存活率分别为１００％（３７／３７）、８６．１％（３１／３６）。     

小鼠胚胎干细胞培养相关影响因素的研究

本实验主要探讨饲养层、白血病抑制因子(LIF)、水、血清对小鼠胚胎干细胞培养的影响。结果表明:饲养层细胞在小鼠胚胎干细胞的分化抑制过程中有一定作用,而起主导作用的是外源白血病抑制因子;;经亚沸处理的MilliQ水,能显著提高小鼠胚胎干细胞保持未分化状态的能力;;血清的品质对小鼠胚胎干细胞的培养效果影响显著(p<0.05)。