水牛促卵泡素受体(FSHR)基因5''''端侧翼序列的克隆与分析

促卵泡素(FSH)是动物脑垂体分泌作用于卵巢卵泡生长、发育、分化、成熟和排卵的重要繁殖激素.由于是生物大分子,不能透过细胞膜,FSH必须与靶细胞膜上的促卵泡素受体(FSHR)结合,经过受体介导将信息传递到靶细胞内,才能发挥其生物学功能.目前国内外已对牛、山羊等多种动物的FSHR基因的Cdna序列进行了克隆测序,但是关于水牛FSHR基因5'端侧翼序列还未见报道.本研究对水牛FSHR基因5'端序列进行克隆和序列分析,其目的是寻找水牛FSH受体基因的SNP突变位点,从而为以后进行FSH受体基因的多态性分析和探索该受体基因在水牛繁殖中的可能作用打下基础.     

牛、羊促卵泡素受体(FSHR)基因转录调控区的序列特征

测定了山羊、绵羊和牛的FSHR基因启动子区序列。比较发现序列长度存在差异，碱基变异率分别为3．14％、6．12％和6．72％。有2处较大的碱基插入／缺失突变。在检索出的转录调控元件（或潜在调控元件）中，3畜种在7个元件序列有碱基突变。与人和大鼠FSHR基因不同的是，在牛羊的FSHR基因启动子区检索出了TATA盒基元和多个类CAAT盒序列，且在山羊、绵羊和牛之间没有碱基差异。分析认为：（1）牛羊的FSHR基因启动子属TATA启动子型，而不是InR型。（2）尽管目前在绵羊的FSHR基因只发现1个转录起始点，但启动子区的序列特征表明牛羊可能存在第2转录起始点。（3）3畜种在转录调控元件的碱基变异和在不同位点的较大插入／缺失突变，可能影响基因的转录，从而造成双胎率的差异。因此，对牛羊FSHR基因转录启动和表达调控值得作进一步研究。     

山羊FSHR基因第10外显子的PCR-SSCP检测及其序列分析

利用PCR-SSCP技术检测山羊(Caprahircus)包括西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊173个个体FSHR基因第10外显子的单核苷酸多态性(SNP)。结果未发现SNP位点。测序后获得山羊FSHR基因第10外显子的核苷酸序列,并在NCBI数据库中获得GenBank登录No.DQ069909和DQ069910。通过DNA序列分析发现,FSHR基因第10外显子第120位碱基不存在C→T的转换,也不存在颠换等其它遗传变化。山羊、绵羊(OvisariesL.)和普通牛(Bostaurus)FSHR基因第10外显子序列同源性比较和聚类分析结果表明,山羊、普通牛和绵羊该部分序列的相似性最高为99.3%;在物种间比较中,绵羊和普通牛纯合子该基因外显子序列的不相似性最高为3.4%;据FSHR基因外显子序列构建的分子系统树结果显示,山羊、绵羊和普通牛物种内的个体各自聚为一类;山羊和绵羊先聚为一类,然后再与普通牛聚为一类。提示FSHR基因第10外显子的核苷酸序列适合于物种间的动物分子树的构建。     

of Goat Follicle-stimulating Hormone Receptor (FSHR) Gene

利用PCR-SSCP技术检测山羊(Capra hircus)包括西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊173个个体FSHR基因第10外显子的单核苷酸多态性 (SNP)。结果未发现SNP位点。测序后获得山羊FSHR基因第10外显子的核苷酸序列， 并在NCBI数据库中获得GenBank登录No.DQ069909和DQ069910。通过DNA序列分析发现， FSHR基因第10外显子第120位碱基不存在C→T的转换，也不存在颠换等其它遗传变化。山羊、绵羊 (Ovisaries L.) 和普通牛( Bos taurus) FSHR基因第10外显子序列同源性比较和聚类分析结果表明，山羊、普通牛和绵羊该部分序列的相似性最高为99.3%；在物种间比较中，绵羊和普通牛纯合子该基因外显子序列的不相似性最高为3.4%；据FSHR基因外显子序列构建的分子系统树结果显示，山羊、绵羊和普通牛物种内的个体各自聚为一类；山羊和绵羊先聚为一类，然后再与普通牛聚为一类。提示FSHR基因第10外显子的核苷酸序列适合于物种间的动物分子树的构建。     

水牛β-酪蛋白5′启动区的克隆和序列分析

水牛β-酪蛋白是水牛奶中最重要的蛋白质之一。本实验参照奶牛、绵羊、山羊的β-酪蛋白结构基因序列设计了一对引物P1、P2，以本地水牛基因组为模板，采用高保真Ex Taq酶，LA—PCR扩增得到水牛β-酪蛋白基因的5′启动区序列，克隆到pMD18一T上，测序后得到长4．4kb的序列。与牛、山羊和绵羊同区段基因序列进行多重序列比较，并根据多重序列比较结果预测了该区中包含的核心启动子序列TATA盒、5′-LUTR(非翻译区)、乳腺组织特异性转录因子(MGF)等重要元件。以该区序列构建的部分反刍动物的进化树与实际的进化关系保持了很好的一致。     

水牛Follistatin cDNA克隆及序列分析

卵泡抑索（Follistatin,FS）可通过旁分泌和自分泌的方式抑制促卵泡素（FSH）的分泌,从而影响动物的繁殖机能。本研究拟通过分析水牛的FS cDNA序列来分析其繁殖性能低的可能原因。试验参照GenBank公布的奶牛的FS cDNA序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增目的基因,再将其亚克隆到pMD-18T克隆载体进行测序。测序结果显示本试验成功获得了水牛的FS cDNA序列。同源性及进化树分析提示FS在哺乳动物进化上高度保守。研究发现两处氨基酸的突变,这可能影响FS正常的生物学功能发挥,从而影响水牛的繁殖机能。     

水牛催乳素受体基因克隆及序列分析

扩增出广西本地沼泽型水牛（Bubalus bubalis）催乳素受体（PRLR）基因部分保守序列,用于下一步实验检测体外培养的水牛乳腺上皮细胞中催乳素受体基因的表达水平。根据已报道的奶牛催乳素受体基因cDNA序列的保守区,设计一对特异性引物。提取广西本地水牛的乳腺组织总RNA,并以其为模板,以下游特异性引物为反转录引物,在反转录酶（AMV）作用下合成cDNA;用Ex-Taq酶进行PCR扩增,得到催乳素受体基因的保守序列,长度为571bp。该扩增产物经纯化后,连接到pMD18-T载体上扩增。经序列分析结果表明：序列较保守,与GenBank上发表的奶牛催乳素受体基因的同源性达到98．9％,与绵羊的同源性达到96．5％,与猪、小鼠、人的同源性分别为86．5％、78．9%、77．1％。催乳素受体基因与奶牛相比,共有6个碱基发生了突变,其中1个为同义突变,其他5个均为错义突变,形成4个氨基酸发生变异。     

抑制素A对牦牛颗粒细胞FSH、LH及其受体表达的影响

为了探明抑制素A(INHA)对牦牛卵泡颗粒细胞中促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)与其受体结合发挥的作用,通过体外培养牦牛卵泡颗粒细胞,采用免疫荧光技术(IF)检测促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在颗粒细胞中的分布情况,用不同浓度外源性INHA(0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL^-1)作用12 h后,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测颗粒细胞中FSHβ、LHβ、FSHR、LHR基因的表达情况,采用酶联免疫分析试验(ELISA)检测细胞内外FSH、LH的含量。结果显示,FSHR和LHR在颗粒细胞质与细胞核中均有表达。FSHβ和LHβ基因在颗粒细胞中的表达随INHA浓度的增大呈先降后升的趋势;INHA浓度接近5 ng·mL^-1时,FSHβ表达最低;INHA浓度接近10 ng·mL^-1时,LHβ表达最低;FSHR和LHR基因的表达与INHA浓度呈负相关。INHA浓度接近5 ng·mL^-1时,颗粒细胞内外FSH含量最低;INHA浓度接近10 ng·mL^...     

山羊IL-2基因cDNA的克隆、鉴定及序列分析

根据GenBank发表的山羊（Capra hircus)IL-2基因序列，设计了一对引物。以ConA刺激的外周血淋巴细胞为材料用RT－PCR的方法。从总RNA中扩增出山羊IL－2基因。琼脂糖电泳显示扩增片段约为500bp。分离纯化片段，克隆入表达质粒pBV220，经酶切鉴定，测序结果显示，克隆的山羊IL－2基因与GenBank上发表的序列一致。该序列与绵羊（Ovis aries)和牛(Bas taurus)的IL－2基因序列同源性最大，在96％以上，氨基酸和抗原性比较分析认为，山羊IL－2与绵羊及牛的IL－2在这两方面有较大的同源性。     

苹果α-法尼烯合酶基因的启动子序列及同源基因

本文通过设计引物进行PCR扩增α-法尼烯合酶(AFS)基因的5'端区段并测序,获得510bp的‘国光’苹果AFS基因启动子和5'端非翻译区(5'UTR)序列,已在GenBank注册(登录号FJ263961)。序列分析结果表明,该序列具有典型的启动子特征,在转录起始点上游-46bp处有一个TATA盒,-93bp处有一个CAAT盒,-84bp处有一个W盒和-436bp处有一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT。与‘皇家嘎拉’苹果的AFS基因启动子序列(GenBank登录号AY786553.1)比对,本研究发现‘国光’苹果AFS基因启动子序列中有6个碱基(-186T,-207T,-283C,-301A,-413A和-433A)发生变异,‘皇家嘎拉’苹果AFS基因启动子序列相应位置的碱基分别为碱基缺失、-206C、-282G、-300G、-412G和-432G。重要的是,其中‘国光’苹果-413A碱基变异为G发生在一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT中,苹果虎皮病发生和AFS基因的转录表达是否受到这一碱基变异的影响值得进一步探讨。本研究结果还表明,在苹果AFS基因启动子和5'UTR序列中存在一个正向...     

指导外源基因在动物乳腺特异性表达载体的构建

为了实现外源蛋白质在动物乳腺中特异性表达,采用PCR法扩增了BLG 3'端含第6,7外显子及poly(A)加尾信号下游约200 bp的0.87 kb片断.以山羊BLG 5'的3.2 kb(含第1,2外显子)启动子,山羊BLG 3' 0.87 kb序列,鸡 -珠蛋白基因簇基因上游的 2.4~ 5.3 kb HindⅢ序列,绿色荧光蛋白GFP及原核载体pGEM-7zf构建了pGEM-7zf-GFP-MAR-5' BLG-3' BLG的乳腺特异性表达载体,将外源基因插入BLG 5'端EcoRⅠ位点,或许可能实现其在乳腺中位置独立性表达.     

西农萨能羊47kD尾部相互作用蛋白基因(TIP47)的cDNA克隆、序列结构分析与组织表达

47kD尾部相互作用蛋白基因(tail-interacting protein47,TIP47)是影响脂滴形成和代谢的重要基因。本实验以西农萨能羊(Capra hircus)的乳腺组织为研究材料,采用RT-PCR和RACE,克隆了山羊TIP47基因的cDNA全长序列。结果得到TIP47基因cDNA序列全长1906bp(GenBank收录号为:HQ846827),包括5'UTR82bp,完整编码区1314bp及3'UTR510bp,编码蛋白质的氨基酸数为437,分子量47.36kD,等电点(pI)5.14。对TIP47基因的核苷酸和氨基酸序列分析发现,山羊的TIP47与GenBank中牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和猪(Sus scrofa)的TIP47相似性较高。蛋白质结构分析显示,TIP47不存在信号肽序列和跨膜结构;疏水性分析发现,其N端疏水性较强,中间靠近C端部分亲水性较强;三级结构分析发现,其C端呈大写的L形;该基因的遗传距离分析发现,山羊与牛的亲缘关系最近,其次是猪和人。通过RT-qPCR技术对TIP47基因进行了组织表达分析,发现所检测...     

gBTN1A1基因的筛选、克隆及序列分析

利用抑制消减杂交技术研究西农萨能羊泌乳中期和末期的乳腺组织差异表达基因，构建消减文库，得到山羊嗜乳脂蛋白的部分序列，根据牛和绵羊基因组序列进行电子拼接，设计引物，得到山羊嗜乳脂蛋白的CDs区全序列，应用RT-PCR技术从山羊乳腺组织总RNA中扩增克隆了山羊嗜乳脂蛋白基因CDs区，命名为gBTN1A1,并登录Genbank（EF102891）。gBTN1A1全基因由7个外显子和6个内含子组成，开放读码框由1581个碱基,编码526个氨基酸，gBTN1A1基因核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性为97%, 88%, 84%，蛋白质序列的同源性为96%, 84% and 70%。其二级结构、跨膜区域及信号肽分析与牛、人和鼠相似，所以推测gBTN1A1与乳脂肪球的分泌密切相关，根据其在泌乳期表达丰度的差异推测其可能影响山羊产奶量。     

广西沼泽型水牛γ-干扰素基因的克隆与原核表达

本研究克隆了广西沼泽型水牛γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)基因,并构建了水牛IFN-γ原核表达质粒。从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导培养13 h后,提取细胞总RNA,用水牛IFN-γ基因特异性引物通过RT-PCR扩增水牛IFN-γ成熟肽编码区cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中。RT-PCR产物电泳可见约457 bp大小目的片段。经过限制性酶切分析,测序证实克隆得到的基因序列正确。将IFN-γ成熟肽编码区基因片段切下亚克隆到表达载体pET-32a 中,构建成重组表达质粒pET-mIFN-γ。PCR、双酶切电泳和序列测定结果均证实已插入约457 bp的IFN-γ基因片段。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,水牛IFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高效的表达,融合蛋白的分子量为35 ku,表达量占菌体总蛋白的43.6%。     

团头鲂和广东鲂生长激素cDAN的分子克隆和序列分析

从团头鲂（Megalobrama amblycephala）和广东鲂（Megalobrama hoffmanni）的脑垂体组织提取总RNA,采用3′－RACE－PCR的方法,从中扩增出编码两种鲂生长激素（growth hormone,GH）成熟肽的cDNA序列,克隆到pGEM-T Easy Vector载体上。克隆的团头鲂和广东鲂GHcDNA均包括编码188个氨基酸残基的GH成熟肽序列和3′端的非翻译区,但不含信号肽序列和5′端非编码区。序列分析结果表明,团头鲂和广东鲂GH的碱基序列和推测的氨基酸序列的同源性分别为99％和100％。     

西农萨能奶山羊激素敏感脂酶基因CDS区的克隆与生物信息学分析

根据GenBank已收录的牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种激素敏感脂酶(HSL)基因序列的同源保守区域,设计特异性引物,利用RT-PCR技术,从西农萨能羊乳腺组织中克隆得到了山羊(Caprar hircus)HSL基因的CDS,并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列以及蛋白质结构进行了生物信息学分析.结果表明,山羊HSL基因CDS全长2 271 bp,编码756个氨基酸残基(GenBank登录号为:EU273879),与牛、人和小鼠的核苷酸序列同源性分别为96%、86%和79%;氨基酸序列的同源性分别为96%、85%和83%;其蛋白质的分子量为82 583.7 D,等电点为6.23,其氨基酸序列中存在较强的疏水区域,三级结构存在一个α/β水解酶折叠区域,该特征与牛、人及小鼠的HSL基本一致.     

小尾寒羊MTNR1A基因外显子2的克隆与序列分析

对常年发情的绵羊品种小尾寒羊和季节性发情的绵羊品种多赛特羊共20只母羊的褪黑激素受体1A(melatonin receptor 1A，MTNR1A)基因外显子2的824 bp扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明, 小尾寒羊MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列与已发表的绵羊序列(GenBank登录号U14109)完全相同。小尾寒羊与多赛特羊MTNR1A基因外显子2的差异由5个变化的核苷酸(分别为C329T、G355T、C566T、C580A和A675G)组成，核苷酸同源性为99.4%。小尾寒羊与山羊、母牛、猪、人、小鼠、挪威大鼠、西伯利亚仓鼠和鸡之间MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列同源性为73.2%～98.5%，氨基酸序列同源性为78.5%～98.5%。     

牛杀菌/通透性增加蛋白氮端片段的原核表达

目的 克隆牛杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA,构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达BPI蛋白,并纯化重组蛋白。方法 参照Genbank报道的序列,应用RT-PCR技术,从牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白基因,然后将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。结果 获得BPI N端长度为714 bp的基因片断,序列分析证实该片断中有1个点突变。大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量约为52×103的GST-BPI融合蛋白。结论 成功的表达和纯化了BPI重组蛋白。     

牛Oct4基因克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

为了克隆奶牛Oct4基因开放性阅读框全序列,并建立高效、稳定产生逆转录病毒质粒pMSCV-Oct4的包装细胞株.我们以50～60日龄的胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR的方法扩增出牛Oct4基因全序列,全长为1 083 bp与GenBank公布的序列的同源性为99.4%.将其插入到逆转录病毒载体pMSCVneo的多克隆位点,获得重组逆转录病毒质粒pMSCVneo-Oct4.鉴定正确后,通过Lipofectamine2000将其转导入包装细胞PT67,用含有G418的培养液进行抗性筛选,获得阳性细胞克隆.细胞上清经过RT-PCR、透射电镜及病毒滴度测定等方法鉴定,证实所包装病毒存在,其滴度值为8.83×107 cfu/mL.试验结果表明我们已获得携带牛Oct4基因的高滴度感染性逆转录病毒.     

西农萨能奶山羊gBTN1A1基因的筛选、克隆及序列分析

利用抑制消减杂交技术研究同一只西农萨能奶山羊泌乳中期和末期的乳腺组织差异表达基因,以泌乳中期乳腺cD-NA为测试组,末期乳腺cDNA为驱动组,构建消减文库,得到山羊(Capra hircus)嗜乳脂蛋白基因的部分序列。根据牛(Bos)和绵羊(Ovisaries L.)基因组序列进行电子拼接,并设计引物,得到山羊嗜乳脂蛋白基因的CDs区全序列,应用RT-PCR技术从山羊乳腺组织总RNA中扩增克隆了山羊嗜乳脂蛋白基因CDs区,命名为gBTN1A1,并登录GenBank(EF102891)。gBTN1A1基因开放读码框由1581个碱基组成,编码526个氨基酸,前26个氨基酸为推定的信号肽区域。gBTN1A1基因核苷酸序列与牛(NM-174508)、人(NM-001732)和鼠(AK145168)的同源性分别为97%、88%和84%,氨基酸序列的同源性分别为96%、84%和70%。其二级结构、跨膜区域及信号肽分析均与牛、人和鼠的BTN1A1基因相似。