新城疫病毒JZ05株F基因重组pGAPZα的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株,基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶κpnI和XbaI对目的基因片段及质粒pGAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化Eacterium coli DH5α.以PCR方法确定JZ05 F1的阳性重组子为2个,JZ05 F2的阳性重组子为4个.对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果发现,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1198bp、269bp,与新域疫病毒JZ05株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致.这表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2、研究强毒株与弱毒株F蛋白的抗原性差异程度及研制重组亚单位疫苗打下了基础.     

新城疫病毒La Sota株F基因重组pGAPZα的构建

根据新城疫病毒(NDV)La Sota株F基因序列和毕赤酵母表达载体pGAPZαA多克隆位点序列,设计并合成3对引物,以RT-PCR技术获得NDV La Sota株融合蛋白(F)基因的F1片段和F2片段。将目的基因和质粒pGAPZαA均以KpnⅠ和XbaⅠ进行酶切,以DNA连接酶进行连接并转化Escherichia coliDH5α,转化子经PCR鉴定和酶切鉴定,结果表明构建的重组质粒中含有目的基因片段。将目的基因片段的测序结果与NDV La Sota株F基因序列比对,长度和核苷酸序列一致。     

猪瘟病毒C株E2基因克隆及重组pGAPZα的构建

从猪瘟弱毒活疫苗中提取猪瘟病毒(CSFV)RNA,采用RT-PCR技术,得到E2基因的cDNA,连接到pMD-18T载体上进行测序。将E2基因的cDNA及质粒pGAPZαA分别以内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行顺序酶切,连接酶切产物并转化Escherichia coliDH5α。经过抗生素Zeocin筛选、PCR鉴定和重组质粒的酶切分析,将E2基因的测定序列与GenBank中的CSFV C株E2基因序列(序列号Z46258)比对,核苷酸同源性为99.46%;获得6个阳性重组子的克隆株。结果表明,重组质粒pGAPZα-E2中目的基因E2的核苷酸序列和大小、插入方向和位置是正确的。     

Brazzein基因的合成及pGAPZαA-Bra表达载体的构建

[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。     

新城疫病毒(NDV)F基因的克隆及其真核表达重组质粒的构建

应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和一对自行设计的引物,从新城疫病毒(NDV)F48E9株扩增出长度为1664bp的DNA片段。与已报道的NDV-融合蛋白(F)基因比较,两者大小一致。经限制性内切酶反应,获得两个预期大小的片段。将克隆的F基因定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,证明构建的重组质粒含有NDV-F基因。     

鸡新城疫病毒ND-xx08株 HN 基因的克隆及分析

为克隆并分析新城疫病毒ND-xx08株 HN 基因,将其分离、纯化、培养,提取其病毒的基因组RNA,RT-PCR扩增获得与HN基因预期大小一致的DNA片段,克隆到pMD18-T载体,经EcoR I和Hind III进行双酶切鉴定和测序鉴定.ND-xx08 HN基因的序列长度为1 716 bp,共编码571个氨基酸.与已发表的24株 NDV HN序列的同源性分析表明,其核苷酸序列的同源性在80.0%～98.4%,氨基酸同源性在87.2%～98.2%.研究结果表明,ND-xx08具有强毒株的特性.     

水牛α-清蛋白基因3′端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3′端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性.序列分析结果表明:水牛α-乳清蛋白基因3′端序列与牦牛该基因在641 bp的序列中存在34 bp的差异,同源性为94.69%.     

犬冠状病毒部分纤突蛋白基因的分子克隆

以RT－PCR方法扩增出犬冠状病毒（CCV）YS1、CI1 2株国内分离病毒的部分纤突蛋白基因，经酶切鉴定为CCV特异性核苷酸片段。采用平端连接法将Wizard^TM PCR纯化试剂盒纯化的PCR产物克隆于pUC19 Sma I酶切位点上，获得YS1pUC19、CI1pUC19重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定表明：重组质粒大于蓝斑菌质粒。以BamHI、Kpn I双酶切重组质粒可获得比原PCR产物略大的核苷酸片段，并从中以PCR方法扩增出与原PCR产物大小相同的核苷酸片段。     

传染性胃肠炎病毒陕西分离株S基因主要抗原位点基因的克隆与序列分析

根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒S基因的序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR从用细胞增殖的TGEV病毒液中扩增编码S基因B、C抗原位点的基因片段,然后将获得的片段克隆至pMD18-T载体上,构建重组质粒。通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒,将测序结果与GenBank公布的21个相关序列进行多序列比较并绘制进化树。所克隆的TGEV陕西分离株S基因B、C抗原位点基因片段长度为765 bp,与参考毒株的核苷酸同源性为96.1%~99.9%。进化树分析表明,分离株与中国的H株、HN2002株、TS株,美国的Miller M60株、Miller M6株及英国的FS772株亲缘关系较近,与H株的亲缘关系最近。     

猪TNF-α竞争定量RT-PCR标准曲线的建立

根据GenBank中猪TNF-α的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增402 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T载体中,构建成含TNF-α部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增402 bp片断共用同一对引物,但缺失137 bp的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立猪TNF-α的标准竞争曲线和直线回归方程.     

新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建

应用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得新城疫病毒(NDV)Lasota株的血凝素神经氨酸酶(HN)基因片段,其长度约为1.7 kb,与已报道的NDV-HN基因片段大小一致.再将该HN基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,表明构建的重组质粒含有NDV-HN基因片段.     

山羊痘病毒TK基因的克隆与序列分析

设计特异性引物并应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B株TK基因序列片段,将其克隆至pMD 18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-TK.再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.TK基因核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4株测序毒株TK基因与参考毒株的同源性均为96.6%～100%,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性.     

单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及序列分析

构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (L isteria Monocytogenes,L MO)溶血素基因重组质粒。文章采用 PCR方法扩增出 L MO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin,hly)基因 ,将其克隆到 p MD18- T中 ,转化 E.coil TGI。经酶切及 PCR鉴定 ,而后进行测序。 hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6 bp。重组质粒经酶切及 PCR鉴定表明为正确重组子。核苷酸序列鉴定表明 ,其核苷酸序列与国外报道的 L MO F6 789株、L MO F2 36 5株同源性分别为 99.70 %和 99.39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99.82 %和 98.90 %。在国内首次克隆到 L MO hly全基因 ,为研究hly的功能和探讨 hly蛋白作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。     

水牛α-清蛋白基因3’端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3’端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性。序列分析结果表明：水牛α-乳清蛋白基因3’端序列与牦牛该基因在641bp的序列中存在34bp的差异,同源性为94．69％。     

传染性喉气管炎病毒河南株gB基因的克隆、序列分析及其真核表达载体的构建

【目的】构建传染性喉气管炎病毒(ILTV)的真核表达载体。【方法】从传染性喉气管炎病毒河南株(ILTV-XY)感染的鸡胚绒毛尿囊膜中提取病毒DNA,进行PCR扩增,PCR产物进行T-A克隆与测序,获得了鸡IL-TV-XYgB全基因序列;对ILTV-XY株gB基因与GenBank中读取的5株ILTVgB基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行了比较分析;并将该基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,对构建的重组质粒pcDNA3.1/gB进行酶切、测序鉴定。【结果】序列测定表明,gB全基因核苷酸长度为2 629 bp,编码873个氨基酸,推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点,有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸。与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因进行比较,核苷酸序列同源性为99%以上,与ILTV-SA2株gB基因比较发现,ILTV-XY株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G,而在第102位又都插入1个碱基A,从而引起该毒株gB基因推导的氨基酸序列中第28~32位5个氨基酸的移码突变。构建的重组质粒pcD-NA3.1/gB经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。【结论】成功构建了ILTV的真核表达质粒pcDNA3.1/gB,为ILTV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析,为阐明本病致病机理,更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株(HB-DCZ)基因组RNA为模板,扩增BVDVHB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZcDNA体外扩增获得特异性条带,大小约为665bp,表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆,提取重组质粒,扩增获得特异性的DNA条带,长度约为665bp,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,获得两条DNA片段,长度分别为2600bp和702bp左右,与理论值相符。序列测定结果表明,克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸,NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%,ZM195株97.4%,Osloss株92.3%,C_(24)V株77%,NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入,也没有基因重组、重排或缺失,但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近,与C_(24)V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDVIb基因亚型。     

番鸭细小病毒M91G27株VP3基因的克隆与序列测定

利用 PCR技术 ,从纯化番鸭细小病毒 M91 G2 7毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒结构多肽 VP3基因。将该 PCR扩增片段克隆入 p UC1 8质粒载体的 H inc 和 Sac 位点之间 ,酶切分析筛选到含 1 .6kb基因片段的重组质粒 MP1 3。结果表明 :该片段与国外已报道毒株核苷酸序列有 98.8%的同源性 ,氨基酸序列有 98.1 %的同源性 ,证明该重组质粒是 VP3基因的克隆。     

贵宾犬α-干扰素基因的扩增、克隆与序列分析

参照基因库中收录的犬α-干扰素基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从贵宾犬肝组织基因组DNA中扩增IFN-α基因,将回收得到的特异性片段克隆于pGEM-T Easy载体中,转化感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选,质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性重组质粒,测定其核苷酸序列。测序结果表明,贵宾犬α-干扰素基因全长为564 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸。用DNAStar软件将所得序列与人和其他种动物的IFN-α基因进行核苷酸及氨基酸同源性比较,并通过绘制系统进化树可知,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。     

北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因外显子2的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因的外显子2的267 bp大小的片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中,重组质粒用PCR和酶切分析进行阳性克隆鉴定,然后测定核苷酸序列,并推导其氨基酸序列.北京荷斯坦牛、蒙古牛、人类、瑞典红白花牛、蒙古绵羊、西班牙山羊之间DRB3基因外显子2的核苷酸序列同源性为80.9%～95.5%,氨基酸序列同源性为75.3%～91.0%.     

柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因.用EcoRI和NotI酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用SacI将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达.RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段,是一个子孢子高表达基因.重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达.Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性.