猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR诊断方法的建立与应用

为建立一种快速简便的检测猪传染性胃肠炎的RT-PCR方法,根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的核苷酸序列设计1对引物,并以合成的cDNA为模板,初步建立了猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR检测方法,进而对对照病毒及采集的病料组织进行了敏感性、特异性和重复性检测。结果表明,该研究建立的RT-PCR方法敏感性高,最低核酸检测值为0.5ng/μL,扩增产物特异性好,重复性稳定,可应用于猪传染性胃肠炎病毒的实验室诊断和流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎及流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的序列,利用Primer 5.0设计合成了2对特异性引物。用这2对引物对TGEV、PEDV cDNA模板首先进行单项PCR条件优化,然后采用正交试验设计优化多重RT-PCR反应条件,结果同时扩增到2条与实验设计相符的492bp(PEDV)和211bp(TGEV)特异性条带,建立了能够同时检测2种病毒混合感染的特异、灵敏的多重PCR检测方法,可检测出约11pg的PEDV和13pg的TGEV。     

猪非典型性瘟病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、准确检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,根据GenBank发布的APPV NS2基因序列,设计合成1对扩增后目的基因片段大小为500 bp的特异性引物。建立的RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,该方法对APPV的最低检出量为1μl 4.95×10~4拷贝,重复性试验中组间、组内试验结果均与预期相符。应用该方法对68份疑似患病的仔猪样品进行检测,阳性病料检出率为7.35%。利用Mega7.0绘制APPV系统进化树,对APPV进行遗传进化分析,结果显示本试验检出的APPV(SC株)与中国报道的APPV的亲缘关系较近。建立的APPV RT-PCR检测方法可用于APPV的临床诊断及流行病学检测。     

猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中的猪水泡病病毒(SVDV)高度保守的VP1基因的序列,设计了与SVDV互补的2对特异性引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选,成功地扩增出251bp和366bp特异性条带,将其克隆入pMD18-T载体中,并进行序列测定,与已发表的SVDV基因比较发现,核苷酸的同源性为100%,证实为SVDV的VP1段基因。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等,对照的扩增结果均为阴性,验证其特异。对SVDVRNA进行10倍系列稀释后检测,结果SVDVRNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性,说明具有较好的敏感性。此项试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

为了建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)快速、特异的检测方法,减少猪流行性腹泻(PED)给养猪业带来的损失,根据PEDV的S基因序列设计1对引物,优化扩增条件,建立了针对PEDV的RTPCR检测方法。结果显示,建立的检测方法可特异地检测出PEDV。应用建立的检测方法对2016年河南地区38家发生腹泻的猪场的256份病料进行检测,结果表明,阳性猪场为30家,阳性样本为157份,检出率高于试纸条检测方法。可见,建立的检测方法特异性强,可用于PEDV感染疑似病例的诊断及流行病学调查。     

Porcine kobuvirus RT-PCR detection assay establishment and application in primary epidemiology investigation in Hubei Province

根据猪库布病毒的3D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3D基因和口蹄疫病毒3D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测.敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL.应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性.在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示,猪库布病毒在猪群中集中分布在发生腹泻疫情的猪群,说明猪库布病毒和现阶段的腹泻疫情有紧密的联系.     

复合RT-PCR检测猪乙脑病毒和猪流感病毒方法的建立

根据GenBank上已发表的猪乙脑病毒(JEV)的E基因序列和猪流感病毒(SIV)的NP基因序列,设计合成了2对特异引物,分别建立了JEV和SIV的单项RT-PCR诊断方法,通过对扩增条件的筛选,最终成功地建立了JEV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,利用一次RT-PCR反应,即可同时扩增JEV的349 bp和SIV 155 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)核酸扩增结果为阴性,对JEV和SIV的最低检出量分别为100和10 pg的cDNA. 该方法适合对JEV和SIV的联合检测和鉴别诊断.     

检测猪源牛病毒性腹泻病毒荧光RT-PCR方法的建立与监测分析

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′-UTR保守序列建立的特异性荧光RT-PCR,对采自福州市周边屠宰场的359份屠宰猪血清进行BVDV感染的病原学检测。结果待检的359份血清样品BVDV阳性52份,阳性率为14.5%(52/359)。对其中13份BVDV阳性样品5′端UTR片段进行序列测定分析,发现所测13份BVDV阳性样品5′端UTR片段均与VEDEVAC进化谱系较为密切,均为基因Ⅰ型。以上结果表明以牛源BVDV建立的特异性荧光RT-PCR方法适用于猪源BVDV感染的监测,并揭示福州市屠宰猪存在BVDV感染。     

猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据猪乙型脑炎病毒(JEV)基因序列,设计合成了一对引物,以JEV疫苗株为模板,建立了检测JEV的RT PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为430 bp的特异性目的片段;RT PCR产物测序结果与文献报道的JEV不同毒株的序列同源性达到98%~100%;敏感性测定该RT PCR可扩增到10 pg的JEV-RNA。结果表明,建立的RT PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强。     

猪圆环病毒3型PCR诊断方法的建立及初步应用

为屠宰环节PCV3分子流行病学调查诊断提供参考,根据猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)特异性序列设计引物,通过敏感性试验、特异性试验、重复性试验及测序验证,建立的PCR方法能扩增出649bp的目标片段,其具有较好的敏感性,可扩增的最低模板浓度为0.143ng/μL;并用建立的PCR方法对屠宰场送检的376份组织样品进行检测结果表明,PCV3平均阳性率为12.9%。     

猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

基于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的N基因,建立了PEDV的TaqMan探针RT-PCR检测方法。以标准质粒绘制log10拷贝数与Ct之间标准曲线的线性相关系数值为0.996,检测灵敏度为100拷贝/μL,对传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒和圆环病毒2型等几种猪病毒的检测结果均为阴性,批内和批间的变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性。对不同代次细胞培养上清中的病毒样品进行检测,结果表明该方法能够满足PEDV野毒株分离过程中的病毒定量检测需要。     

一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA或1个TCID50的PRRSV,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<1%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对72份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出40份阳性,高于常规RT-PCR方法(28份阳性)。建立的荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于PRRSV的实验室快速诊断和流行病学调查。     

RT-PCR技术检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)

根据猪PRRSV的ORF7基因序列,设计并合成了1对引物,以PRRSV RNA为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测PRRSV的RT-PCR方法。应用该方法对病毒细胞培养物进行基因扩增,均获得了分子量为443bp的特异性目的片段,而对PCV2、PRV、CSFV及Marc-145细胞进行同条件检测,结果均为阴性;PRRSV扩增产物测序结果与文献报道的PRRSV其他毒株序列同源性达92%~98%。敏感性试验表明,该体系可检测到2.39TCID50的PRRSV;对2004~2005年送检的81份临床样品进行检测,阳性率为23.4%。上述研究结果表明,建立的RT-PCR特异性好、敏感性高,可用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和流行病学调查。     

中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展

2010—2011年中国境内的猪流行性腹泻（PED）大流行给养猪业造成重大经济损失。因疫苗免疫无法控制疫病流行,因此学者普遍认为猪流行性腹泻病毒（PEDV）出现了新的变种。论文综合分析了这个时期国内学者PEDV分子流行病学的研究结果,又对国内新近分离的PEDV的11个毒株的全基因序列进行遗传进化分析,进一步确定了国内暴发流行的PEDV毒株已远离中国86年分离的毒株和欧洲毒株CV777,成为了一个新的基因型。毒株基因变异应该是造成免疫失败和仔猪死亡率高的主要原因。进一步分析发现分离毒株的全长基因序列和棘突蛋白（S）基因序列长度有差异,其他基因长度保守性强。S基因的变异率高于其他基因,特别是短期内基因突变主要发生于S基因。综合分析认为国内变异毒株虽与韩国毒株遗传关系较近,但从境内毒株衍生和进化而来的可能性更大。因2006年已经观察到PEDV的免疫失效和PED流行,2010—2011年PED集中暴发可能是病原长期突变和适应性积累的结果,提示今后应充分发挥全国动物疫病预警网络的作用,加强毒株进化检测和疫病预警,优化疫病的防控手段,降低疫病发生频次和规模,减小疫病发生损失。     

2010—2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV S基因型分析

2010年以来,全国大部分地区暴发新生仔猪严重流行性腹泻,给养猪业造成巨大经济损失。为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)在浙江省的流行和遗传变异情况,对2010—2013年收集的临床腹泻样品,以针对PEDV S基因N端序列的RT PCR检测病原,并测序其中的41份样品的扩增序列,分析PEDV S1基因型变异情况。临床检测结果表明：　PEDV临床检出率由2010年的4286%提高到2013年的70%以上,并且浙江省各地的检出率都在50%以上;一年中7至8月份检出率明显降低。 PEDV S1基因N端序列分析结果表明,临床检测株的S1基因与传统毒株PEDV CV777的S基因序列及中国最早检测到的基因序列亲缘关系较远,可能浙江省PEDV的流行株可能属于一个新的基因型。同时研究结果提示PEDV S基因的变异可能是现有CV777毒株疫苗免疫保护力不佳的原因。     

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012-2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;③本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;④所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×10⁶拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×10¹拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×10³拷贝/μL;⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%（78/249）,母猪粪便中PDCoV的检出率（27.78%）稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率（31.92%）,最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。     

猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV）3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCVB JC3株中扩增出与试验设计相符的286bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCVBJC3株细胞毒的敏感度达到2TCID50;对10份EMCVB JC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

RT-PCR检测齿兰环斑病毒技术的建立

根据已报道的齿兰环斑病毒(ORSV)外壳蛋白(CP)基因序列,进行同源性比较,设计了一对各为20bp的引物.通过优化试验条件,建立了稳定的RT-PCR检测ORSV体系,其检测灵敏度可达0.01ng·mL-1.将此方法与ELISA进行比较,结果表明,RT-PCR检测灵敏度比ELISA高1000倍.应用这两种方法同时检测了138瓶兰花组培苗样品,其中RT-PCR检测出32瓶兰花组培苗感染病毒,而ELISA只能检测其中的18瓶.     

江苏省猪流行性腹泻病毒的流行病学调查

[目的]分析江苏省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况.[方法]采用RT-PCR方法对2013年3月至2014年12月从江苏省9个不同地区采集的174份病料进行病原学检测和流行病学调查,并对来自不同地区9株病毒的部分M基因进行克隆、测序和分析.[结果]江苏省PEDV的个体阳性率为17.92％,猪场阳性率为61.54％;与经典病毒株CV777相比,9株病毒的核苷酸序列和氨基酸序列都有突变.同源性分析表明,江苏省内PEDV毒株的核苷酸同源性为97.8％ ～ 100.0％,但与欧洲毒株的同源性较低;遗传进化分析表明,江苏省PEDV流行株和参考株可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个群,7株江苏省毒株和一些其他国内毒株、泰国毒株、韩国毒株以及美国毒株属于Ⅰ群,而另外2株江苏株与2株泰国株构成了Ⅲ群,而现用疫苗株CV777则属于Ⅱ群.[结论]江苏省内PEDV有一定程度的进化和变异,并且需要选择更有效的疫苗株来控制PEDV的流行.