新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞体外培养体系的建立

利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力,免疫荧光进行鉴定;并通过脂质体介导对分离到的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞分别进行EGFP-N1和DsRed-N1基因转染。结果成功分离到新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,体外可以大量传代和冷冻,目前已经传至50代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光和红色荧光,表明瞬时转染新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞可以获得成功,其中转染DsRed-N1基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞已经传至60代以上。结果表明,本试验成功建立了新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞的体外培养体系,在体外能稳定培养和传代,并可以成功获得转基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞。     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示，猪的卵丘细胞生长形成单层需要5～6d；运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系，这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

供体细胞种类及性别对猪体细胞核移植效果的影响

本研究通过比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞、卵丘细胞和不同性别猪胎儿成纤维细胞的核移植效果,探讨供体细胞的种类及性别对猪体细胞核移植重构胚胎发育潜力的影响。结果表明:胎儿成纤维细胞的融合率(64.74%)高于颗粒细胞的融合率(51.05%)和卵丘细胞的融合率(56.89%),但3种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显著(P>0.05);胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞均可作为供体细胞用于构建猪体细胞核移植的重构胚。雄性胎儿成纤维细胞核移植重构胚的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞重构胚的融合率和分裂率相比差异不显著(P>0.05),但雄性胎儿成纤维细胞核移植重构胚的囊胚率显著低于雌性胎儿成纤维细胞核移植重构胚的囊胚率(P<0.05)。     

猪颗粒细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养与冷冻保存试验报告

本试验利用从成熟后的猪卵母细胞中获得的颗粒细胞与胎儿成纤维细胞作为下一步猪体细胞核移植的供核细胞作好准备,为转基因猪的研究奠定了基础。对从成熟卵母细胞中获得的颗粒细胞进行分离培养和冷冻保存;采用室温消化法分离培养猪胎儿成纤维细胞。结果表明,接种后的原代颗粒细胞和猪胎儿成纤维细胞经过5～6d后均可连生铺满皿底,细胞排列有序,可用于继代培养;猪胎儿成纤维细胞进行冷冻解冻后可以存活。利用成熟后的猪卵母细胞的颗粒细胞,可以简单而快速地分离与培养;通过室温消化法可以分离培养猪胎儿成纤维细胞,并且经过冷冻解冻后可以复苏存活,其存活率为80.2%。     

电融合/激活对于巴马小型猪体细胞克隆胚胎生产的影响

本试验旨在建立适用于猪体细胞克隆的融合/激活体系(试验1),优化融合/激活条件以提高重构卵融合率和激活率,为生产足够数量的克隆胚胎用于胚胎移植最终诞生体细胞克隆猪奠定条件。首先比较脉冲时间确定适合体细胞克隆的最佳融合/激活参数,然后利用此参数验证巴马小型猪耳部成纤维细胞克隆胚胎的发育潜能。结果显示:场强100 V/mm,3次电脉冲,脉冲时间为30μs时适于猪体细胞克隆。在试验2中,利用巴马小型猪耳部成纤维细胞为供体细胞构建体细胞克隆胚胎,得到了较高的卵裂率(83.1%)和囊胚发育率(12.4%)。     

牛胎儿成纤维细胞的分离培养

研究了牛胎儿组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征,并对培养细胞的冷冻保存和复苏进行了观察.采取组织块培养法进行原代培养,在接种第5天到第6天成纤维细胞生长旺盛;用0.25%胰蛋白酶消化,传代培养细胞生长状态良好;用液氮冷冻法保存传代细胞,解冻后持续传代至第12代仍生长良好,第8代细胞冻存前和复苏后的活率分别为97.0% 和94.3%,无显著差异(P>0.05);分离纯化的胎牛成纤维细胞的生长曲线都正常;成功地建立了牛胎儿成纤维细胞系.该细胞可经多次传代培养和冷冻保存.     

胎儿成纤维细胞的培养分离方法对猪体细胞核移植胚胎发育潜力的影响

研究采用不同传代的培养方法和不同方法处理及不同培养分离法探讨胎儿成纤维细胞的处理方法对猪体细胞胚胎发育潜力的影响。结果表明:(1)100%长满汇合胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70%～80%的胎儿成纤维细胞(P<0.05),分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);(2)猪胎儿成纤维细胞冷冻-解冻后的核移植分裂率和囊胚发育率均显著低于新鲜和4℃冷藏的细胞(P<0.05),但融合率无显著差异(P>0.05),表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;(3)采用组织块法和酶消化法分离得到的胎儿成纤维细胞所构建的重构胚胎在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显著差异(P>0.05)。表明100%长满汇合培养是较好的猪胎儿成纤维细胞培养处理方法;猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;组织块法和酶消化法均可用于分离培养猪体细胞核移植的胎儿成纤维细胞。     

不同年龄水牛成纤维细胞DNA甲基化与组蛋白乙酰化水平分析

实验旨在探讨不同年龄水牛成纤维细胞的增殖能力、DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,为水牛体细胞克隆中供体细胞的选择提供理论依据。利用细胞组织块培养法分离培养3月龄胎儿水牛、新生水牛、10岁龄水牛的耳部成纤维细胞,通过绘制细胞生长曲线、细胞免疫荧光和qRT-PCR方法分析细胞增殖能力和DNA甲基化、组蛋白乙酰化水平。结果表明:随着水牛年龄增长,原代成纤维细胞扩展速度不断下降,P2代细胞的生长曲线呈典型的S型,3月龄胎儿水牛成纤维细胞的增殖能力均高于新生水牛和10岁龄水牛(P0.05);3月龄胎儿水牛与新生水牛的DNA甲基化水平低于10岁龄水牛(P0.01),3月龄胎儿水牛成纤维细胞的DNA甲基化转移酶基因DNMT1、DNMT3A低于新生水牛和10岁龄水牛(P0.01);随着年龄增长,水牛成纤维细胞组蛋白乙酰化转移酶HAT1基因的表达降低(P0.01),组蛋白去乙酰化酶HDAC1基因的表达升高(P0.01)。以上结果说明,水牛胎儿成纤维细胞处于低DNA甲基化高组蛋白乙酰化状态,可能更适合作为供体细胞用于水牛体细胞克隆研究。     

猪卵母细胞化学辅助手工去核及手工核移植胚胎发育能力因素的研究

本研究在筛选猪化学辅助手工去核最佳脱羰秋水酰碱(Demecolcine,DC)浓度的基础上,探讨了各种因素对手工重构胚发育的影响,以期建立高效的猪手工体细胞核移植技术体系.观察不同成熟时间卵母细胞在不同DC浓度下的去核效率,并进一步比较了化学辅助手工去核法和荧光染色去核法、不同类型的供体细胞(颗粒细胞、新生巴马肌肉成纤维细胞和胎儿成纤维细胞)和供体细胞的不同处理方法(70％～80％汇合、血清饥饿法和100％接触抑制法)对重构胚发育能力的影响.结果表明:(1)利用DC诱导去核,对体外成熟培养44 h的卵母细胞以浓度0.4 μg· mL-1作用0.5～1 h为宜.(2)用DC化学辅助手工去核与用荧光染色去核的重构胚囊胚发育率差异不显著(13.11％ vs 9.25％,P＞0.05).(3)以胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞为供体构建的重构胚的融合率、卵裂率及囊胚率均差异不显著(P＞0.05).(4)用70％～80％汇合(对照组)组、接触抑制组和血清饥饿组的细胞作供体构建的重构胚,在融合率上,接触抑制组显著高于对照组(P＜0.05);在分裂率与囊胚率上,各组之间均无显著差异(P＞0.05).研究结果表明,化学辅助手工去核法在实际生产中可以替代荧光染色去核法,能省去去核过程中荧光染色及紫外光照射去核等步骤,从而简化了猪手工体细胞核移植程序,提高了猪手工体细胞核移植效率,能为高效的猪手工体细胞核移植技术体系的建立提供参考.     

供体细胞对猪体细胞克隆胚胎早期发育的影响

以中国农业大学实验用小型猪香猪胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞和颗粒细胞3种细胞系为供体细胞进行核移植。比较了血清饥饿法和接触抑制法处理胎儿成纤维细胞诱导进入G0／G1期的效率，发现二者差异不显著（P〉0．05），血清饥饿2d和4d差异不明显，同样接触抑制2d和4d差异也不显著（P〉0．05）。系统研究了影响克隆胚胎发育的供体因素：血清饥饿与否、细胞形态、细胞类型及个体差异等，结果表明：血清饥饿处理对克隆胚的早期发育没有明显的促进作用；圆形光滑细胞有利于细胞融合，对早期发育无显著影响（P〉0．05）；不同个体、不同类型的供体细胞对克隆胚囊胚发育率有一定的影响。     

影响细胞核移植效率的因素

1997年,世界上第一只成年绵羊乳腺上皮细胞核移植后代多利（Dolly）的诞生。标志着核移植技术进人了一个崭新的发展阶段。这一成就具有划时代的意义。而且进一步证实了基因活性学说的正确性,证明高度分化的体细胞仍然具有基因组的等同性,其细胞核仍然具有支持哺乳动物全程发育的全能性。此后,以不同动物不同组织来源的体细胞进行核移植均得到了后代。这些细胞包括颗粒细胞、卵丘细胞、鼠尾尖细胞、乳腺细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管和子宫上皮细胞、转染或未转染的牛生殖嵴细胞、牛肌肉细胞、牛乳腺上皮细胞、肺组织细胞、兔成纤维细胞等。     

猪输卵管上皮细胞、颗粒细胞、耳上皮细胞及胎儿成纤维细胞的培养

本文培养了猪输卵管上皮细胞、颗粒细胞、耳上皮细胞、胎儿成纤维细胞等几种细胞 ,比较了几种细胞原代和传代培养的特点 ,发现原代培养时猪耳组织、胎儿组织消化后的单细胞和剩余细胞团块一起培养 ,其生长速度较单个细胞快。 4种细胞中颗粒细胞体积最大 ,生长速度最慢 ,传代密度须保持 2× 10 5 ml以上为宜。     

不同来源供体细胞及含羞草素对水牛体细胞核移植的影响

本文主要探讨供体细胞类型及含羞草素对水牛体细胞克隆的影响。结果如下:与成纤维细胞相比,卵丘/颗粒细胞可以获得较高的融合率和分裂率,但两者的囊胚率差异不显著;克隆水牛的成纤维细胞能用于核移植,而且对核移植结果没有影响;性别对重构胚的早期发育影响不大;含羞草素处理可以替代血清饥饿处理。     

添加外源激素FSH对绵羊卵丘颗粒细胞增殖的影响

为了分析外源激素促卵泡激素(FSH)对绵羊卵丘颗粒细胞增殖的影响,试验分离并体外培养了绵羊卵丘颗粒细胞,然后使用促卵泡激素受体(FSHR)免疫组织化学法鉴定了分离培养的细胞,进而分析了添加不同浓度FSH对细胞增殖速度的影响。结果表明:将卵丘颗粒细胞从卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合体(COCs)上分离24 h之后,能够观察到部分卵丘颗粒细胞开始贴壁,传代之后细胞形态未发生明显变化。FSHR免疫组织化学法鉴定结果证明分离培养的绵羊卵丘颗粒细胞能够特异性地表达FSHR。培养基中添加FSH后,在培养前4 d,高浓度(100 ng/mL)和低浓度(10 ng/mL)的FSH均能促进卵丘颗粒细胞的增殖,但在培养6 d之后,高浓度的FSH对卵丘颗粒细胞的增殖存在抑制作用。说明外源激素FSH在不同浓度下对卵母颗粒细胞的增殖具有不同的影响。     

猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究

为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。     

野牦牛成纤维细胞的分离培养与传代

为了提高野牦牛成纤维细胞分离培养效果,研究了组织保存方法、原代培养方法、培养液类型、添加细胞生长因子和冷冻保存液配方对野牦牛体细胞分离培养与传代的作用。结果表明,PBS、D/F12和TCM199适合野牦牛皮肤组织的保存,D/F12和TCM199培养液适合组织块培养,组织块成活率达到（86.29±4.62）%,组织块法适合野牦牛成纤维细胞的原代培养;D/F12培养液培养野牦牛成纤维细胞效果较好,群体倍增时间和平台期密度分别为38.47 h和2.075×10⁶/mL,正常二倍体核型百分率为84.33%;表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞因子（bFGF）产生了较明显的促增殖作用,平台期细胞密度明显增加;2种冷冻保存液（D/F12添加胎牛血清和二甲亚砜及胎牛血清添加二甲亚砜）均能用于野牦牛细胞冷冻,细胞存活率分别是87.33%和89.00%。     

梅山猪耳成纤维细胞体外培养及其克隆

为获得适合于克隆梅山猪的供体细胞,本试验对梅山猪耳皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化、生长特征和核型分析等进行了研究。通过组织块培养法获得梅山猪皮肤成纤维细胞,用胰酶轻度消化后传代3⁴次可得到较纯的皮肤成纤维细胞,并以此作为供体细胞,获得1头健康梅山克隆猪。     

老年猪耳成纤维细胞建立及克隆胚胎发育

为保存江苏地方猪种的种质资源,通过采集猪耳结合低温运输进行老年猪耳组织块贴壁培养,建立猪耳成纤维细胞,进而将细胞扩繁传代并冷冻保存。通过规范采样流程,结合低温运输方式,使运输时间达到8h以上,扩大了采样范围,同时,使污染风险由前期的30.77%(13头)降低到目前的8.3%(12头)。虽然老年猪耳成纤维细胞在初期游离到铺满培养瓶需要21d,远高于胎儿(怀孕24d的胚胎)成纤维细胞,但其后期的冻存与解冻培养均不受影响。随后,利用手工克隆技术生产克隆胚胎,老年猪耳成纤维细胞作为供体囊胚率(27.04±4.08)%与新生猪耳成纤维细胞作为供体囊胚率(28.8±2.37)%相比,无显著差异(P>0.05)。本试验结果证明老年猪耳成纤维细胞培养及冻存的可行性,为利用体细胞与体细胞核移植对地方猪种种质资源的保存提供支持。     

绵羊胚胎成纤维细胞的体外培养

用组织块法对绵羊胚胎成纤维细胞进行原代和传代培养,探讨绵羊胚胎成纤维细胞适宜的培养模式.成功获得较均一稳定的细胞群体,并成功地对细胞进行了冷冻保存和复苏.对于进行大规模的动物细胞培养具有重要的指导意义.     

我国科学家新建立两种基因敲除克隆猪模型

中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员、吉林大学教授赖良学博士的研究团队针对猪的酪氨酸酶、PARK2和PINK1基因的外显子设计了Cas9打靶质粒，将其分别转染版纳小型猪的胎儿成纤维细胞和巴马小型猪的胎儿成纤维细胞后，获得了纯合的酪氨酸酶基因敲除以及PARK2和PINK1双基因敲除的细胞系。细胞系用于体细胞核移植后获得15头酪氨酸酶基因敲除克隆猪，20头PARK2和PINK1双基因敲除克隆猪。