柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...     

鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速实现对鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)同时进行检测的双重PCR方法,基于2种艾美耳球虫各自的ITS-1基因筛选2对特异性引物,对制备的阳性DNA样品进行PCR扩增,凝胶电泳检测结果显示,分别在约450bp和150bp处出现目的条带。对PCR反应中的退火温度、MgCl2浓度、DNA模板量等进行优化。结果表明,当退火温度为59℃、MgCl2浓度为2.5mmol/L、DNA模板量为2μL时,双重PCR扩增结果最佳。特异性检测结果显示,所建立的双重PCR对环形泰勒虫、羊巴贝斯虫、隐孢子虫和蓝氏贾第虫的扩增结果均呈阴性,表明建立的方法具有较高的特异性。成功建立了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法,为临床中鸡球虫病的快速诊断提供了一种可靠的检测方法。     

柔嫩艾美耳球虫研究概况

本文简要介绍柔嫩艾美耳球虫生活史、生物学特性、卵囊形状、以及卵囊产量的影响因素，对柔嫩艾美耳球虫日龄与粪便卵囊产量进行科学的分析，旨在为疾病的治疗和预防提供依据。     

柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍法从孢子化7h的卵囊中提取总RNA，链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA与E再用oligo(dT)n-纤维素从总RNA中分离mRNA。mRNA以Not Iolig(dT)15作第一链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA用Ecor I Aaptors的连接后，经Not I酶切，再与EcoR I和Not I预切好的λ载体连拉，构建成鸡球虫cDNA文库。     

2株柔嫩艾美耳球虫对5种抗球虫药的抗药性

选择130只21日龄雏鸡，研究了柔嫩艾美耳球虫（E.tenella)南京株和凤阳株对地克珠利（Diclazuril)、马杜霉毒（Maduramicin)、氯羟吡啶（Clopidol)、氯苯胍（Robenidine)和氨丙啉（Amprolium)的抗药性。试验鸡随机分成13组，其中每株球虫均设5个感染用药组，1个感染不用药组，另设1个不感染不用药组，每组10只鸡。以POAA，RLS，ROP，ACI作为指标。结果表明，2株柔嫩艾美耳球虫均对氨丙啉轻度抗药，对地克珠利敏感或轻度抗药，对氯羟吡啶中度抗药。对马杜霉和氯苯胍中度抗药或安全抗药。提示：目前在凤阳地区可合理地使用地克珠利和氨丙啉，对氯羟哟啶应慎用，对马杜霉素和氯苯胍须减少或暂停使用。     

鸡球虫病四价活疫苗对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫效果观察

为评价一种商品化鸡球虫病四价活疫苗[柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫]对E.necatrix和E.tenella的免疫保护效果,本研究基于试验鸡血便记分、存活率、相对增重率、病变值、卵囊值及抗球虫指数(ACI)等指标对其免疫效果进行检测.结果表明,免疫攻虫组抗E.necatrix和E.tenella的ACI分别为157.3和135.6,均低于160,表明该球虫疫苗抗两种球虫的效果均为低效.然而,免疫攻虫组鸡血便数量、血便记分、增重、卵囊产量和病变记分等指标均优于阳性对照组.综合指标显示,该疫苗对E.necatrix和E.tenella具有一定的免疫保护力,但单纯采用疫苗并不能够达到防控鸡球虫病的目的.     

柔嫩艾美耳球虫的分离鉴定与致病性测定

本实验采用单卵囊分离技术分离纯化球虫,并根据其临床病理变化、潜隐期、最短孢子化时间等指标综合判定其为柔嫩艾美耳球虫。用纯化所得球虫卵囊进行致病性试验,结果表明:该柔嫩艾美耳球虫致病力较强,半数致死量为7.52×104个/只。     

巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对8种抗球虫药的敏感试验

为检测巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对常用抗球虫药的敏感性,选用地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星、盐霉素和拉沙洛西等8种抗球虫药进行鸡体试验,通过抗球虫活性百分比（percent of optimum anticoccidial aetivity,POAA）、病变记分减少率（reduction of lesion scores,RLS）、相对卵囊产量（relative oocyst production,ROP）和抗球虫指数（anticoccidial index,ACI）4项指标进行综合评价。结果表明,巨型艾美耳球虫早熟株对8种药物敏感;柔嫩艾美耳球虫早熟株对盐霉素轻度敏感,对地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星和拉沙洛西敏感。本研究结果可为对球虫早熟株疫苗的开发与应用提供实验依据。     

柔嫩艾美耳球虫YL株抗药性研究

用柔嫩艾美耳球虫杨凌株 ( YL t)对 1 4日龄雏鸡进行感染 ,检测了该虫株对 4种常用抗球虫药 (马杜拉霉素、地克珠利、克球粉和氯苯胍 )的敏感性。以最适抗球虫活性百分率、抗球虫指数、相对卵囊产量和病变记分减少率为指标 ,进行综合评定 ,其抗药程度分为无抗药性、轻度抗药性、中度抗药性和完全抗药性 4个等级。结果表明 ,该虫株对马杜拉霉素有轻度抗药性 ,对地克株利有完全抗药性 ,对克球粉和氯苯胍无抗药性。     

柔嫩艾美耳球虫MIF基因克隆及生物信息学分析

【目的】克隆柔嫩艾美耳球虫巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)基因CDS区,探究其生物信息学特征,为后续抗原表位筛选提供理论依据。【方法】采集晋中地区疑似柔嫩艾美耳球虫感染的阳性样本进行PCR鉴定,根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫MIF基因序列,利用RT-PCR技术扩增MIF基因CDS区,构建pET28a-EtMIF重组质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析;利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质、结构和功能等进行预测。【结果】成功克隆了柔嫩艾美耳球虫MIF基因CDS区序列,全长348 bp,共编码115个氨基酸,相对分子质量为1.203×10⁴。系统进化树结果表明,柔嫩艾美耳球虫MIF基因氨基酸序列与毒害艾美耳球虫的亲缘关系最近,相似性为98.3%。MIF蛋白为非跨膜、可溶性、非分泌型蛋白,亚细胞定位主要在细胞质中,共有10个磷酸化位点;含有1个保守结构域,二级结构由无规则卷曲(35.65%)、延伸链(30.43%)、α-螺旋(27.83%)和β-转角(6.09%)组成,...     

地克珠利、氨丙啉与左旋咪唑联合使用对Eimeria tenella的效力试验

目的研究地克珠利与氨丙啉、左旋咪唑的联合抗球虫效果。方法应用均匀设计法对地克珠利、氨丙啉和左旋咪唑的各6个不同剂量进行优化配伍,试验设立6个药物试验组,并设药物对照组、感染不给药组和不感染不给药组。除不感染不给药组外,其余全部试验鸡每只接种E.tenella孢子化卵囊1×105个,以抗球虫指数(AC I)判定药物的疗效。结果地克珠利5 mg/kg+氨丙啉240 mg/kg+左旋咪唑1.5 mg/kg组的雏鸡存活率为100%,相对增重率97.5%,病变值15.5,其AC I 181.97;而地克珠利2 mg/kg组的AC I仅为79.35;其余各组AC I均在150~170之间。结论本试验中以地克珠利5 mg/kg+氨丙啉240 mg/kg+左旋咪唑1.5 mg/kg为最佳抗球虫药物组。     

三株柔嫩艾美球虫野外分离株的致病性分析

用每鸡4×104和8×104个孢子化卵囊的剂量感染黄羽肉雏,以临床症状、肉眼病变、平均增重、病变记分和死亡率为判定指标,对柔嫩艾美球虫EtCZ-1、EtCZ-2、EtCZ-3株的致病性进行了比较分析。结果显示:各虫株引起的临床症状和肠道肉眼病变基本相似,致病性随着感染剂量的增加而增强。各感染组的增重与对照组相比均有显著差异(P<0.50),相对增重率分别下降了74.4%～83.2%、68.7%～72.2%和70.6%～74.4%;感染后鸡出现血便的时间较一致,即第108小时开始排血便,在120h～144h达高峰;病变值和卵囊值均随着感染剂量的增加而增大;除EtCZ-1株高剂量组的存活率是90%以外,其余各组均为100%。显示3株球虫的致病性相似。     

马杜霉素对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)超微结构的影响

将马杜霉素按 0 .0 0 0 5 %的比例混入饲料 ,作用于鸡体内柔嫩艾美耳球虫 (Eimeria tenella) ,透射电镜观察 ,发现裂殖体变小 ,内含裂殖子的数目减少 ,裂殖子膨胀变为椭圆 ,裂殖子间 (带虫空泡内 )微管结构模糊、膨胀 ,裂殖体中有髓鞘样结构出现 ;细胞膜外突和细胞质分离形成空隙 ,细胞膜有破损、结构模糊 ;细胞质出现空泡化 ,内部出现附加体和髓鞘样结构 ;少数细胞核的外膜外突和内膜分离 ,有的部位的核膜模糊、破损。裂殖子顶体结构发生异常变化 ,棒状体消失 ,微线数目减少或者消失。线粒体表现为形态改变 ,肿大变圆 ,或者变为马蹄形 ,内膜和嵴脱落 ,内部形成空泡、膜状结构、螺旋状或者髓样结构 ,线粒体的嵴与长轴平行排列 ,且贯穿线粒体。作者推测 ,抗生素类抗球虫药的作用机理可能是 ,通过使虫体结构的完整性受损 ,抑制虫体的物质代谢及能量代谢等生理机能 ,达到杀死虫体或者抑制虫体生长、发育和繁殖的目的。     

柔嫩艾美耳球虫交叉抗药性试验

以雏鸡为试验对象,以抗球虫指数(ACI)为判断指标,检测5 mg/kg马杜霉素,70 mg/kg盐霉素,1 mg/kg 地克珠利对抗盐霉素株、抗地克珠利株和实验室保存的敏感株的控制效果。结果表明,马杜霉素对3 个虫株都有很好的抑杀效果,地克珠利也可有效地控制抗盐霉素株,同时,盐霉素也可有效地控制抗地克珠利株,说明盐霉素和地克珠利2种药物之间没有交叉抗药性。     

柔嫩艾美球虫（Eimeria tenella）体外细胞培养

试验比较了玻璃珠层析法,ＤＥＡＥ纤维素层析法,Ｇ３漏斗过滤法３种提纯柔嫩艾美球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａ）子孢子的方法,柱高８ｃｍ,直径２００μｍ的玻璃株柱用ｐＨ８．０的Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ缓冲液作洗脱提纯子孢子,回收率为６４．１％,子孢子洗脱高峰期集中,且易于无菌操作,柱高５ｃｍ的ＤＥＡＥ纤维素柱用ｐＨ８．０的甘氨酸缓冲液作洗脱液,提纯子孢子回收率为６３．２％,但严格无菌操作困难,Ｇ３漏斗法易     

鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株的抗药性研究

使用柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)西宁株(Et XN)感染13日龄岭南黄肉鸡,进行该虫株对轻灭(地克珠利,Diclazuril)、马度米星铵预混剂(Maduramicin Aminonium Premix)、球痢灵(磺胺氯吡嗪钠,Sulfachoropyridazine)、球迪2000(盐酸氯丙啉,Amprolium Hydrochloride)4种药物的抗药性研究。以相对卵囊产量(ROP)、病变记分减少率(RLS)、最适抗球虫活性百分数(POAA)、抗球虫指数(ACI)作为指标进行综合判定。结果表明:该虫株对马度米星铵预混剂具有轻度抗药性,对球痢灵具有中度抗药性,对轻灭和球迪2000具有完全抗药性。     

雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后脂质过氧化物的变化

为了探讨柔嫩艾美耳球虫 (E.tenella)对感染雏鸡的损伤机制 ,本试验给 10日龄海兰白公雏鸡口服柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊 8× 10 4个 /只 ,在感染后 2、4、6、7、9、12、16和 2 1d分别各取 5只雏鸡剖检 ,取盲肠并采血 ,观察盲肠病理组织学变化 ,测定盲肠组织及血清中的丙二醛 (MDA )、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH- Px)的水平。结果表明 ,雏鸡在感染 E.tenella后 2～ 4d,盲肠开始出现损伤 ,同时 SOD和 GSH- Px活性也开始下降 ;感染后 4～ 7d,盲肠粘膜上皮和肠腺上皮细胞大量变性、坏死崩解 ,发生严重损伤时 ,盲肠及血清中 MDA含量显著增加 ,并持续到 9d,同时 SOD和 GSH- Px活性也显著下降 ;感染 9d后 ,损伤的盲肠组织及 MDA、SOD和 GSH- Px水平逐渐恢复 ,至 2 1d基本达到正常