鸡胚致死孤儿病毒Ⅲa蛋白基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

通过随机引物PCR鉴定了鸡(Gallus domesticus)胚孤儿致死病毒(CELOV)污染鸭肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒。根据GenBank上已公布的核苷酸序列，自行设计一对引物。PCR扩增到1728bp的特异性条带，将其在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达，产物蛋白经Western blot鉴定为阳性后，又长程免疫小白鼠获得抗Ⅲa蛋白的抗血清。间接免疫荧光实验(ⅢA)鉴定蛋白产物具有抗原性。     

miR-let-7a在大白猪甲状腺中的表达及其对甲状腺细胞凋亡的影响

microRNA(miRNA)是一类内源性的非编码RNA,广泛参与细胞的生长发育、分化、增殖和凋亡等生物学过程.为了研究miR-let-7a对猪(Susscrofa)甲状腺的生长发育及甲状腺细胞凋亡的调控作用,本研究利用免疫荧光技术鉴定了大白猪的甲状腺组织及体外培养的甲状腺细胞,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了miR-let-7a在不同生长阶段大白猪甲状腺组织中的表达量变化,通过转染miR-let-7a mimics并利用流式细胞术检测了转染组与未转染组的甲状腺细胞凋亡率的差异性,同时预测了miR-let-7a与细胞凋亡相关基因的靶向关系.结果发现,甲状腺组织和细胞中的甲状腺球蛋白(thyroglobulin,TG)发出绿色荧光,表明体外培养的甲状腺细胞功能正常.qRT-PCR结果显示,胚胎期随着胚龄的增加,miR-let-7a表达量逐渐增加.出生后miR-let-7a表达量下降,于60日龄达生长期最小值,之后有所上升,至90日龄后其表达量再次下降,120日龄后随日龄的增加let-7a表达量呈现逐渐增加的趋势.凋亡结果发现,和对照组相比,转染组细胞凋亡率明显升高(P＜0.05).根据研究结果推测,miR-let-7a的表达直接或间接影响了甲状腺细胞凋亡的调控过程.研究结果为深入研究猪甲状腺miR-let-7a的功能机制提供了有益的线索.     

鸡MxA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至载体pMD-T18中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒增殖干扰实验和VSV-CEF微量细胞抑制实验进行分析、鉴定。结果表明,经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GenBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰实验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45kD的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致,影像分析系统分析显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。     

鸡胃肠道生长抑素(SS)mRNA表达的组织特异性

以30dArborAcre(AA)肉鸡为模型,采集胃肠道样品,采用相对定量RT-PCR方法研究了生长抑素(SS)mRNA在鸡胃肠道分布的组织特异性。结果表明,腺胃SSmRNA的表达量高于所有肠段,差异极显著(P<0.01);十二指肠和空肠SSmRNA的表达丰度相似,二者均显著高于回肠(P<0.05)。定性研究显示,肌胃和结直肠均有SSmRNA表达,但其表达量显著低于腺胃、十二指肠、空肠和回肠。SSmRNA在主要的消化(腺胃)、吸收(十二指肠和空肠前段)器官的高丰度表达,提示SS对营养物质的消化吸收具有重要的调控作用。异性     

鸡C/EBPα抗血清制备及组织表达的特性

制备鸡（Gallus gallus）CAAT增强子结合蛋白α（CAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα）的多克隆抗血清,并分析其组织表达特性。通过限制性酶切,从T-C/EBPα质粒中获得C/EBPα基因的编码区序列（coding sequence,CDS）,构建原核表达载体,以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主,用IPTG诱导重组pGEX6p/C/EBPα的表达,经Glutathione Sepharose 4B柱层析纯化后,以其为免疫原制备兔抗鸡C/EBPα多抗。ELISA方法测定抗体效价达1∶12800,Western blot方法显示抗体具有较高的特异性。用此抗血清分析了鸡C/EBPα的组织表达特性,结果表明,鸡的回肠、肾脏、肌胃、腺胃、心脏、肝脏、腹脂、脾脏等组织中C/EBPα蛋白表达量较高,而在胸肌、腿肌中表达量较低。同时分析C/EBPα基因在高低脂系公鸡肝脏组织中的表达差异,结果显示该基因在低脂系公鸡肝脏中表达量较高。     

T7RNAP基因的克隆及其质体定位表达载体的构建

为在番茄成熟果实组织中建立T7/T7RNAP质体转基因特异与高效表达系统,本文克隆了原核T7RNAP基因,在添加上质体定位信号肽编码序列后,由番茄果实成熟特异表达启动子PDS和Tnos终止子控制,构成了含有PDS-ptT7RNAP-Tnos基因表达盒的植物基因双元表达载体。该研究为在番茄质体工程中控制外源质体转基因在番茄成熟果实成熟组织中定点表达奠定了基础。     

表达鸡Ⅱ型干扰素重组鸡痘病毒的构建及其特性分析

将鸡Ⅱ型干扰素(ChIFNγ)基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681-ChIFNγ。将pSY681-ChIFNγ转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒rFPV-ChIFNγ。在含有X-ga1的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选，通过PCR和间接免疫荧光等实验证实获得纯化的、表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒。将在鸡胚成纤维细胞中培养72h的rFPV-ChIFNγ上清接种小鼠成纤维细胞(L929)，通过细胞病变抑制实验证明重组ChIFNγ具有抑制水疱性口炎病毒复制的活性，培养上清的抗病毒效价为2048U／mL。     

鸡γ-干扰素基因的瞬时表达及其抗病毒活性检测

采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到IFN-γ基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中。将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染CEF细胞,24小时后经间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹（Western-blot）检测,表达蛋白具有良好的免疫原性。然后利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组水疱口炎病毒（VSV*GFP）在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性（AVA）,经检测其抗病毒活性为2×103AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断。结果表明：ChIFN-γ在鸡胚成纤维(CEF)细胞中成功表达,并且表达的ChIFN-γ具有良好的抗病毒活性。     

鸡β-防御素-1真核表达载体构建及其在Flp-In-293细胞中的表达

以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1（Gallinacin-1,Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值。本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1（＋）载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达。本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础。     

WRKY转录因子表达谱的研究进展

环境胁迫对植物的生长发育造成重大影响,因此,提高植物的抗逆性是农业面临的重要问题。自然界中存在多种抗逆基因,如抗盐基因、抗旱基因、抗寒基因等。利用植物基因工程和分子生物学技术提高植物对逆境的适应性及其抗逆分子机制的研究已成为当今热点。WRKY转录因子是一类参与多种胁迫反应的诱导型转录因子,本文综述了WRKY转录因子家族的结构特点、WRKY转录因子在非生物胁迫（高温、低温、干旱、盐）、外源物质（激素及O3）处理及生物胁迫下的表达模式。各种胁迫下的表达谱均呈现不同特点,这些差异表达可能与它们所行使的不同生物学功能有关。     

山东地方鸡MHC B-F基因遗传变异与免疫性状相关性研究

鸡主要组织相容性复合体(MHC)由一组紧密连锁的、高度多态的基因座位所组成,在机体的免疫应答和调控等方面具有极其重要的作用.本研究旨在研究3个地方鸡(Gallus domestic us)品种(鲁禽鸡、琅琊鸡、石岐杂鸡)Major histocompatibility complex (MHC) B-F基因遗传变异与Sheep red blood cell (SRBC)、Avian influenza (AI)和Newcastle disease(ND)免疫抗体滴度等免疫性状的关系,揭示不同品种间基因变异与免疫性状的相关性.研究结果表明:3个品种SRBC免疫抗体滴度石歧杂鸡最高,与另外两个品种差异极显著(P＜0.01); ND、H9抗体滴度趋势与SRBC一致,石歧杂另外两个品种差异极显著(P＜0.01); H5抗体滴度石歧杂鸡最低,与另外两个品种差异极显著(P＜0.01);亲缘关系较近的琅琊鸡和鲁禽鸡在4个抗体间结果基本一致,2个品种间差异均不显著(P＞0.05).通过PCR-SSCP方法分析了包括MHC B-F基因外显子2在内长度为396 bp的片段.在这3个品种中分别发现了49、45和41个核苷酸变异位点,其中分别有40、37和32个引起了氨基酸突变,关联分析结果表明:3个品种中分别有6、9、4个SNPs位点与所检测的免疫性状显著相关(P＜0.05).亲缘关系最近的鲁禽和琅琊鸡其基因变异与免疫性状相关性基本一致,二者共有5个变异位点与免疫性状相关性一致,其中位点A192C、A217G均与新城疫抗体滴度显著相关(P＜0.05),位点A217G与禽流感H5抗体滴度显著相关(P＜0.05),位点A211G与禽流感H9抗体滴度显著相关(P＜0.05),位点G232A与绵羊红细胞抗体滴度显著相关(P＜0.05).在石歧杂鸡中位点C183G与新城疫、禽流感H9抗体滴度显著相关(P＜0.05).研究结果对于临床疫苗的使用具有重要的指导作用.     

Sleeping Beauty (SB)转座子介导增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)体内转染鸡胚胎

为了探索转座子介导技术在鸡胚中的转染效果,本研究采用鸡蛋开窗法将Sleeping Beauty (SB)单质粒转座载体pT2-SV40-EGFP-SB11注射至孵化36 h鸡(Gallus domes ticus)胚盘中,同时设开窗不注射组和不开窗组.利用体视荧光显微镜和RT-PCR方法检测增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达率,并比较不同阶段的胚胎成活率、孵化率以及蛋重变化.结果表明,EGFP在鸡胚胎中获得较高的表达率(40％～89％);开窗组和不开窗组在胚胎发育早期蛋重变化差异不显著(P＞0.05),而后期开窗注射组的蛋重比例显著低于不开窗组(P＜0.05);三组胚胎的成活率和孵化率在整个发育过程中变化显著(P＜0.05).本实验初步证明了经改良的鸡蛋开窗法可用于鸡胚转基因研究,并初步建立了SB转座子介导外源基因在鸡胚中转染方法.     

miR-122靶向调控鸡BZW2基因的表达

miR-122(MicroRNA-122)是在肝脏中高表达的miRNA,在肝脏的生长发育和脂类代谢等过程发挥重要作用,BZW2 (basic leucine zipper and W2 domains 2)主要参与蛋白质合成代谢,本研究目的是确定BZW2是否为miR-122调控的靶基因.通过生物信息学预测miR-122的靶基因,并分析BZW2的3-UTR区域与miR-122种子区的配对情况,再用双荧光素酶报告系统和突变实验证明miR-122作用于BZW2的3'UTR.用荧光定量PCR检测转染miRNA-122mimic的鸡(Gallus gallus)肝癌细胞系(leghorn hepatocellar,LMH)细胞和转染LNA-antimiR-122的鸡原代肝细胞中BZW2的表达.鸡BZW2的3'-UTR区域与miR-122种子区互补配对,荧光素酶报告基因和突变实验分析表明,miR-122能够通过与BZW23'-UTR区结合抑制基因的表达;将miR-122在LMH细胞中过表达后,发现BZW2 mRNA表达水平显著下降;利用LNA-antimiR-122抑制鸡肝脏原代细胞中的miR-122后,BZW2 mRNA表达水平呈显著性上升.结果证明BZW2是miR-122的靶基因,其在mRNA水平上受到miR-122的负性调控,本研究为揭示miR-122在鸡肝脏中的广泛的功能提供了理论依据.     

梅岭土鸡原始生殖细胞的生物学特性

作为精原细胞和卵原细胞的祖细胞,由于其全能性的特点可作为体外胚胎发育研究的良好模型,而禽类独特的生理和发育特点使得其原始生殖细胞(PGCs)在转基因研究中有着巨大价值。本研究通过对孵化5.5d的梅岭土鸡(Gallus domesticus)胚生殖腺中分离得到的PGCs,接种于24孔培养板在温度37℃、95%空气和5%CO2的培养箱中进行体外培养;借助组织化学及免疫组织化学染色对PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)、SSEA-1(胚胎阶段特异性表面抗原-1)以及TERT(端粒酶反转录酶)进行了鉴定;采用荧光定量PCR技术对PGCs阶段特异性表达基因Cvh(鸡Vasa基因同系物)、Cdh(鸡死端同系物)、Dazl(类无精症缺失)和干细胞多能性相关基因PouⅤ(POU结构域Ⅴ类转录因子1)、Nanog(nanog同源异型盒)、Sox-2(性别决定区Y盒2)基因表达进行了分析;利用脂质体介导法,将绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因导入鸡PGCs细胞,结果表明,PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP、SSEA-1以及TERT染色阳性;PGCs阶段特异性表达基因Cvh、Cdh、Dazl和干细胞多能性相关基因PouV、Nanog和Sox-2在鸡PGCs中均远远高于在鸡成纤维细胞(CEF)中的表达;转染24h后,绿色荧光蛋白均匀的充满细胞质和细胞核,转染效率最高为16%,研究结果为禽类PGCs分化过程中基因调控及基因标记、转基因动物克隆等技术提供了良好基础。     

鸡源沙门氏菌的血清型、耐药性和耐药机制调查

沙门氏菌(Salmonella)是一种重要的食源性致病菌,为了解不同地区鸡源沙门氏菌的血清型、耐药性和耐药机制,本研究对从北京和陕西地区分离的110株鸡(Gallus domesticus)源沙门氏菌进行了分析。血清型结果表明,沙门氏菌流行株为肠炎沙门氏菌(S.enteritidis),占76.58%。微量肉汤稀释法检测110株沙门氏菌对13种抗菌药物的耐药性,结果显示对多粘菌素E的耐药性最强,耐药率为41.82%,其次依次为磺胺异噁唑(31.82%)、氨苄西林(29.09%)和多西环素(20.91%),对其余9种药物的耐药率均低于20%。耐药机制研究结果表明,相关耐药基因在耐药菌株中的携带率较高,Ⅰ类整合子主要携带氨基糖苷类、磺胺类、林可胺类等药物的耐药基因,该整合子在沙门氏菌耐药性的传播方面具有重要作用,本研究为鸡源沙门氏菌的流行性分析以及兽医临床沙门氏菌感染的科学用药提供了基础资料。     

鸡DGAT2基因第7外显子多态性与生产性能的关联

二脂酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是催化真核生物甘油三酯合成最后一步反应的关键酶和限速酶,包括DGAT1和DGAT2两种.DGAT2对调节脂肪代谢、脂类在组织中的沉积及生长发育发挥重要作用.为研究鸡(Gallus gallus)DGA T2基因遗传多态性及其与生产性能的相关性,本研究以固始鸡×安卡鸡杂交F2资源群体(n=860)为研究材料,利用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术检测DGAT2基因的多态性,并分析多态性与生长性状、肉质性状、屠体性状、血液生化指标和肌纤维性状之间的关联性.结果显示,DGAT2基因第7外显子g.13955位置存在一个同义突变位点(C→T),PCR扩增产物被限制性酶Taq Ⅰ酶切消化后显示出CC、CT和TT三种不同基因型,基因型频率分别为0.49、0.48和0.03,等位基因A和B的频率分别为0.73和0.27.相关性分析显示,固始鸡×安卡鸡F2代个体初生重,2、4周龄体重、4、8周龄体尺指标及肌内脂肪含量在不同基因型之间差异显著(P＜0.05),CC基因型多数性状值显著高于TT基因型,对其他指标在统计学上无显著影响(P＞0.05).由以上结果可以推测,鸡DGAT2基因g.13955C＞T与生长发育有关,且C等位基因为优势基因,有望成为家禽品种选育的潜在DNA分子标记.     

鸡Perilipin1基因的克隆及亚细胞定位

本研究旨在克隆鸡(Gallus gallus)脂滴包被蛋白基因(Perilipin1)的cDNA序列,并检测其在鸡前脂肪细胞分化过程中的亚细胞定位.本研究以7周龄肉鸡腹部脂肪组织为材料,采用RT-PCR和RACE的方法扩增并克隆了鸡Perilipin1基因的5'UTR、CDS和3'UTR片段,分析了该基因的结构;以鸡原代前脂肪细胞为材料,利用免疫荧光及激光共聚焦技术,在诱导分化的不同时间点(12～120 h),检测了鸡Perilipin1在前脂肪细胞中的表达位置.结果表明,本研究获得的鸡Perilipin11基因5'UTR、CDS和YUTR序列总长度为2 379 bp,该基因由9个外最子、8个内含子组成(ATG位于第二外显子上);在鸡原代前脂肪细胞诱导分化过程中,Perilipin1始终包被在脂滴周围.综上,本研究成功克隆了鸡Perilipinl基因的完整cDNA序列并确定了Perilipin1在鸡前脂肪细胞分化过程中与脂滴的空间位置关系,该结果为深入开展鸡Perilipinl基因的功能研究,揭示鸡脂肪代谢的分子遗传机理提供了重要的理论依据.     

鸡肝脏胆汁酸结合蛋白(L-BABP)抗血清制备及组织表达特性分析

制备鸡(Gallus gallus)肝脏胆汁酸结合蛋白(L-BABP)的多克隆抗血清,并分析L-BABP的组织表达特性.利用RT-PCR扩增L-BABP基因的CDS区,构建鸡L-BABP基因的GST融合蛋白表达质粒pGEX-4T/L-BABP.将重组表达质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导后产生GST/L-BABP融合蛋白,利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化目的蛋白,将纯化的GST/L-BABP融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗血清.诱导得到了1个38 kD(12 kDL-BABP+26 kD GST)的融合蛋白,经间接ELISA方法测定制备的抗血清效价为1:100 000.利用此抗血清分析鸡L-BABP的组织表达特性,结果表明该基因仅在肝脏组织中特异性表达,在肾、肺、腿肌、腺胃、胸肌、心脏、脂肪、脾、回肠、肌胃、空肠和十二指肠等12种组织中没有检测到表达信号.本研究制备的高效价、高特异性的鸡L-BABP抗血清,为从蛋白水平上深入研究L-BABP的生物学功能提供了良好的基础.