猪FUT1基因启动子区的确定及活性分析

F18大肠杆菌(Escherichia coli F18,E.coli F18)是养猪(Susscrofa)业中发生最普遍、危害最大的病原菌之一,球系列鞘糖脂生物合成通路及通路中α-(1,2)岩藻糖转移酶1基因(alpha(1,2)fucose transferase 1,FUT1)对断奶仔猪F18抗性具有重要调控作用.本研究运用生物信息学技术挖掘课题组前期获得的断奶仔猪转录组测序结果,确定FUT1基因的转录起始位点和启动子区.同时对启动子区序列进行CpG岛分析;采用双荧光素酶报告基因以及AliBaba 2.0软件,分别分析启动子区活性和CpG岛序列潜在的转录结合位点.通过比对人类(Homo sapiens)和猪的基因序列信息数据库,结果表明,FUT1基因转录起始区域具有5种可变剪接(AS-1,AS-2,AS-3,AS-4和AS-5)和2个启动子区域(启动子1和启动子2);双荧光素酶报告基因检测结果进一步显示,FUT1基因启动子2的转录活性极显著高于启动子1的转录活性(P＜0.01),启动子2的活性是启动子1的2.75倍,根据结果可以推测启动子2在转录过程中起主导作用;CpG岛分析显示,猪FUT1基因启动子1和启动子2分别存在一个CpG岛.FUT1启动子1扩增片转录因子预测分析表明,FUT1基因启动子1存在20个潜在的转录因子结合位点,并且Sp1出现在多个转录结合位点处.本研究结果为猪FUT1基因的甲基化检测和调控机制分析提供一定的基础和依据.     

秦川牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1基因(Nramp1)N端序列的原核表达及纯化

为了研究牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的功能,探求转基因抗胞内感染菌牛新材料创制的功能基因,本实验应用RT-PCR方法从秦川牛(Bos taurus)外周血中扩增出Nramp1编码基因N端序列,并将其克隆到pMD18-T simple载体,酶切后连接于pGEX-4T-1表达载体,命名为pGEX-N2。将重组质粒pGEX-N2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测GST-Nramp1-N融合蛋白表达,并筛选最佳诱导条件,用谷胱甘肽Sepharose4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,牛Nramp1N端编码序列长186bp,与GenBank中的相应的牛基因序列(U12862.1)对比存在一个碱基差异,致使其编码的第49位氨基酸为丙氨酸。构建的牛Nramp1N端表达重组质粒pGEX-N2,于35℃、0.1mmol/LIPTG、诱导10h,在大肠杆菌中高效表达,表达产物的分子量为33kD。结果为进一步研究牛Nramp1在机体抵抗胞内菌感染中的作用并为利用该基因进行转基因抗病牛的培育提供了实验依据和实验材料。     

粤油7号花生AhNCED1基因启动子克隆及其活性分析

AhNCED1是干旱胁迫下花生中调控脱落酸（abscisic acid,ABA）生物合成的关键基因。本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗旱性强的粤油7号花生中克隆AhNCED1基因起始密码子ATG上游2392bp启动子序列,构建该启动子驱动报告基因GUS的植物双元表达载体pAhNCED1p∷GUS,转化野生型拟...     

番茄果实特异表达启动子ESp1的克隆及表达

E8启动子是番茄果实成熟乙烯响应性基因E8的启动子区。这个区域中存在着一些响应乙烯以及在果实发育和成熟过程中起调节作用的顺式作用元件，调节E8基因在果实成熟过程中表达（Deikmaa et al．，1998）。本研究根据GenBank中E8基因的启动子区序列设计引物，从番茄基因组中克隆了该启动子，构建了番茄果实特异表达载体，并通过RT-PCR和gus基因检测了该表达载体的果实特异表达活性。     

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP（SEPALLATA）类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1,基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA—box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、BoxI和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE—motif以及胁迫响应元件HSE、TC—richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1,protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5＇调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

拟南芥AtEXP1基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了研究拟南芥扩张蛋白AtEXPA1基因启动子上与转录调控有关的元件,我们通过PCR技术克隆了AtEXPA1基因上游897bp具有启动子活性的序列,再将启动子作不同程度截短,所有片段与GUS基因融合,构建植物表达载体,采用基因枪轰击拟南芥叶片和PEG介导转化烟草原生质体,通过定性和定量检测GUS的活性,发现在靠近翻译起始密码子的上游144bp之间存在增强转录活性的元件。将PEG介导转化的烟草原生质体,分别进行光诱导,冷诱导, 脱落酸（ABA）,盐处理,根据GUS定量检测的结果,推测（1）在AtEXPA1基因启动子上广泛存在与光调控有关的元件,（2） -897～-626 bp之间存在冷负调控元件, （3）-626～-444 bp之间存在与ABA负调控有关的元件,（4）-626～-282 bp之间存在与盐负调控有关的元件。     

猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)启动子克隆及其分析

本研究旨在对猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)的转录调控机制进行初步探讨.首先通过PCR方法扩增MC4R基因5’上游启动区l 234 bp(-1 264～-31 bp)的片段,再利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,最后采用步移缺失获得了11段长度不等的启动子片段,并分别克隆到荧光素酶(LUC)报告基因表达质粒(pGL3-Basic)中.同时,通过双荧光素酶报告活性分析检测MC4R基因启动子区不同长度片段在猪上皮型肾细胞(PK15)中瞬时转染后的活性.结果表明,猪MC4R 5’端-682 bp处存在1个潜在的转录起始位点(TSS),细胞检测结果显示-514～-486bp区域内存在控制MC4R基础转录活性的顺式调控元件,推测该序列内的热休克转录因子(HSF)结合位点可能对MC4R基因的表达调控及功能行使具有重要作用.     

棉花Bax inhibitor-1基因启动子的克隆及初步验证

为研究克隆自陆地棉的GhBI-1A和GhBI-1B基因的表达差异及其响应不同物生和非生物胁迫的分子机制,利用BD GenomeWalkerTM Universal Kit的染色体步移技术得到了2个棉花GhBI-1A和GhBF1B基因5’端上游的启动子序列,长度分别为1650bp和2001bp.生物信息学分析表明,GhBI-1A和GhBI-1B的启动子序列均存在TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件,GhBI-1B启动子中还含有真菌诱导应答元件.以表达载体pBI101为基础,用所克隆的2个棉花GhBI-1基因启动子序列与GUS报告基因融合,构建新的植物表达载体并转入农杆菌.用叶盘法侵染烟草进行瞬时表达,结果表明2个启动子均能够驱动报告基因的表达.     

番茄果实特异表达启动子E8p1的克隆及表达

E8启动子是番茄果实成熟乙烯响应性基因E8的启动子区。这个区域中存在着一些响应乙烯以及在果实发育和成熟过程中起调节作用的顺式作用元件,调节E8基因在果实     

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。     

仔猪多胺代谢相关基因的克隆及断奶对其mRNA表达的影响

多胺是一类广泛分布于组织细胞内的天然低分子多价生物活性物质,在动物的消化、营养代谢以及正常生长中发挥重要作用。本实验克隆了猪(Susscrofa)的7个与多胺代谢相关的基因,分别是精氨酸脱羧酶(ADC)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、鸟氨酸转氨酶(OAT)、鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白1~3(OAZ1、OAZ2、OAZ3)及多按调控因子-1(PMF1),基因片段长度分别是1602(GenBank No.EU545649)、1422(GenBank No.EU534186)、1465(GenBank No.EU404089)、874(GenBank No.EU545195)、678(GenBank No.EU545196)、667(GenBank No.EU545197)及703bp(GenBankNo.EU534185),开放阅读框的长度分别是1380、1383、1313、681、568、559和615bp,编码的氨基酸数目分别是460、461、439、227、189、186和205。经过比对分析,猪ADC基因编码的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为89.7%和87%;猪ODC与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和大鼠(Rattus norvegicus)的同源性分别为93.1%、89.8%和90.5%;猪OAT与人、小鼠的同源性分别为91.8%、90.5%和89.8%;猪OAZ1与人、大鼠及小鼠的同源性分别为93.4%、82.5%和83.8%;猪OAZ2与人、大鼠及小鼠的同源性分别为99.5%、98.9%和98.9%;猪OAZ3与人、小鼠和大鼠的同源性分别为90.4%、87.5%和84.2%;猪PMF1基因编码的氨基酸序列与人和小鼠的同源性为84%和70.9%。半定量RT-PCR分析表明,断乳后ADCmRNA的表达量在盲肠和直肠有所增加,其他各组织均有所降低;ODCmRNA的表达量在直肠和盲肠有较大增加,结肠、回肠和空肠的表达量均呈小幅降低;OATmRNA在肾的表达量有明显增加,十二指肠、空肠和回肠都有降低;除了胃,OAZ1mRNA在其他组织表达水平均有所增加;OAZ2mRNA的表达量在所有组织均有不同程度增加,盲肠居首;OAZ3mRNA在肠道组织的表达量均有不同程度增加;PMF1mRNA的表达量在结肠、空肠和回肠与抗酶家族相似,但断乳后有小幅降低。研究结果提示,多胺对仔猪的生长、发育、成熟、适应性和损伤后的恢复具有重要的生物学作用。     

梅山猪氨肽酶基因N(pAPN)cDNA克隆、序列分析及重要变异位点的筛选

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)蛋白是猪(Sus scrofa)传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪的流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)等一系列冠状病毒的受体蛋白。为探讨梅山猪APN基因的分子结构特征以及重要的变异位点,本研究通过PCR扩增和测序技术,结合生物信息学分析梅山猪APN基因功能区域和重要变异位点,对其蛋白质结构进行预测和分析。结果表明,梅山猪APN基因cDNA全长2 886 bp(GenBank登录号:KF280271),含有20个外显子,编码961个氨基酸。与GenBank数据库公布的标准序列(登录号:NM_214277.1)相比,梅山猪APN基因编码区变异共引起10处氨基酸突变与2处氨基酸缺失,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108 Ile、Ser330Pro、Trp399Arg和Glu465 Gly等6处突变位于APN酶催化活性区域,Gln747His突变、748Tyr和749Ser缺失突变位于APN病毒结合区域。蛋白结构和编码产物功能分析发现,pAPN为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有1个跨膜螺旋(跨膜区位于12~34氨基酸,二级结构元件以α螺旋和β折叠为主,编码产物主要参与细胞被膜(cell envelope)、中央中间代谢(central intermediary metabolism)、辅酶因子生物合成(biosynthesis of cofactors)等功能。Gln747His、748Tyr和749Ser缺失突变可能与氨肽酶N结合病毒能力有关。本研究对梅山猪pAPN基因功能的分析及变异位点的筛选,为今后筛选猪抗病毒性腹泻的有效遗传标记提供理论基础。     

猪CD8B表达谱、基因多态性及其与血液免疫性状的关联分析

白细胞分化抗原8(cluster of differentiation 8,CD8)是主要表达在CD8+T细胞表面的共受体和信号转导分子.CD8B基因编码CD8蛋白的β链,在免疫应答中起着潜在的调节作用.为分析CD8B基因在猪(Sus scrofa)不同组织中的表达特征,并探究CD8B基因多态性对血液免疫性状的遗传效应,本研究利用qRT-PCR测定CD8B基因在大白猪7个组织中的表达量,并用PCR产物测序与限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法对382头大白猪、84头长白猪和90头松辽黑猪CD8B基因编码区进行SNPs检测,以及分析CD8B基因突变对大白猪外周血T淋巴细胞亚群和血常规指标的影响.结果表明,CD8B基因在脾脏中的mRNA表达量最高,然后依次是肺脏、胃、肝脏、肾脏、心脏和肌肉.CD8B基因外显子5处检测到1个错义突变(c.602G＞A),在大白猪、长白猪和松辽黑猪群中均存在3种基因型(AA、AG和GG型),且3个猪种都是GG为优势基因型.统计分析显示,CD8B基因多态性与大白猪血液中的CD4+CD8-、CD4 CD8+、CD4 +/CD8+、血红蛋白含量(hemoglobin,HGB)和红细胞压积(hematocrit,HCT)指标显著相关(P＜0.05).最小二乘分析表明,3种CD8B基因型个体具有不同的血液参数,其中GG型的CD4+CD8-指标显著高于AG型,AG型的CD4-CD8+指标显著高于GG和AA型,GG和AA型的CD4+/CD8+、HGB和HCT指标显著高于AG型(P＜0.05).因此,CD8B基因可能参与血液生理指标的调控,可作为影响猪免疫性状的重要功能候选基因.本研究为进一步揭示CD8B基因的生物学功能提供依据,也为猪的标记辅助抗病育种提供了基础资料.     

莲藕多酚氧化酶基因(PPO)的克隆与表达分析

为获得莲藕中多酚氧化酶(Ppo)基因序列信息及其表达情况,运用PACE技术从莲藕(Nelumbonucifera Gaertn.ssp.nucifera)茎尖中克隆到多酚氧化酶基因全长序列,其cDNA全长2 074 bp,完整的编码框为1 503 bp,编码501个氨基酸,5’端有160 bp非编码区,3’端有411bp非编码区(GenBank登陆号为HQ380894).采用生物信息学方法发现该蛋白分子量约为56.8 kD,pI为8.60,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白,a-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中.半定量RT-PCR结果显示,该基因在莲藕茎尖、幼叶、莲藕鲜切片、花瓣、茎杆5种组织中均有表达.方差分析表明,茎尖中PPO表达量与幼叶差异不显著,但显著高于其余三个部位;幼叶中表达量与莲藕鲜切片之间差异不显著,但显著高于花瓣和茎杆;花瓣和茎杆中PPO表达量最低,两者无显著差异.上述结果说明作为重要分生组织的莲藕茎尖产生的PPO可能不具活性或极不稳定,随着植株的生长发育被分配到各组织中,在特定时空下被激活并担负相应的职责功能.     

睡美人转座子真核表达载体的构建及在猪胎儿成纤维细胞系中的表达验证

睡美人(sleeping beauty,SB)是Tc1/mariner转座子超家族的一员,为探索睡美人转座子与不同的转座酶搭配使用及与同种转座酶不同比例搭配使用时的转座效率,本实验构建了SB真核表达重组载体PT2-SV40-EGFP,通过荧光显微镜和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测进行了猪胎儿成纤维细胞系(PEFs)转染条件优化研究.研究结果表明,不同转座酶与转座子按10∶1混合后细胞转染效率相似,但报告基因表达水平有较大差异,其中SB 100X转座酶与转座子混合后细胞的表达水平最高;转座子PT2-SV40-EGFP质粒和SB 100X转座酶质粒按不同比例混合转染细胞研究表明,细胞转染效率相似,但表达水平存在显著差异,其中1∶1组最高,约是5∶1组和10∶1组的50倍.本实验优化了睡美人转座子的转座条件为制备转基因动物深入研究提供参考.