水稻抗纹枯病基因OsSeh1的克隆及功能鉴定

为了挖掘抗水稻纹枯病的相关功能基因,本研究从日本晴(Oryza sativa L.spp.japonica,var nippobare)水稻品种中克隆了1个编码核孔蛋白的基因,命名为Os Seh1。该基因与拟南芥中的At Seh1同源,且不同植物物种的Seh1具有相同的保守结构域。Os Seh1蛋白定位于烟草叶片细胞核内。水杨酸和纹枯病病原菌均能诱导水稻Os Seh1的表达,水杨酸诱导48h时Os Seh1表达量达到最高值,约为诱导0h的2倍;而立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)诱导24h时Os Seh1表达量达到最高,为诱导0h的3.5倍。接种纹枯病病原菌15d后,转基因过表达水稻植株比野生型抗性高,而RNA干扰(RNAi)植株比野生型更感病。抗病性显著的T1过表达植株中Os Seh1的相对表达量为6~11,比野生型相对表达量高3~4倍,而感病性显著的RNAi植株中Os Seh1的相对表达量为0.2~0.6,表明Os Seh1的表达水平与水稻对纹枯病病菌的抗性正相关。本研究初步证明了Os Seh1在水稻抗纹枯病中的重要功能,为利用水稻自身基因资源提高纹枯病抗性提供了新思路。     

与南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白P10互作的寄主因子筛选

为找到水稻中与南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)外壳蛋白P10(CP)相互作用的寄主蛋白,利用P10筛选水稻膜系统酵母双杂cDNA文库,寻找水稻中与P10互作的蛋白并结合生物信息学技术进行分析,回转验证.结果表明,筛选到10个可能与P10互作的水稻寄主蛋白,如胚发育晚期丰富蛋白Lea14-A、硫氧还原蛋白TRXh1、...     

绿竹花发育相关BoAG-like基因的克隆与表达特性分析

AG基因属于MADS-box家族,在决定花分生组织特性和花器官发育中起着重要的作用。为阐明竹类植物AG基因的表达特性,本研究以绿竹开花试管苗花芽为植物材料,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了完整的cDNA序列,命名为BoAG-like。序列分析结果表明,BoAG-like长度为792 bp,具有AG基因特有的AG Ⅰ区和AG Ⅱ区;BoAG-like与水稻OsMADS58、玉米ZAG1和毛竹PhMADS3的AG-like同源蛋白所编码的氨基酸序列同源性达到80%以上,均属于C类基因的eu-AG系;蛋白的三级结构预测结果表明,BoAG-like与水稻OsMADS58和二穗短柄草BdMADS18最为接近,但也存在明显差异;实时荧光定量PCR结果表明,BoAG-like基因在花器官的表达量明显高于营养器官的表达量,且其表达量随着绿竹花发育进程呈上升趋势;BoAG-like的表达量在绿竹花芽不同部位存在显著差异,其中在雌蕊中最高,外稃中最低。本研究结果为进一步深入研究竹子花发育的分子机制奠定了一定的理论基础。     

普通小麦TaSEC14p-5基因的克隆及表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白Sec14是最先在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的磷脂酰肌醇转运蛋白,含有一个典型的SEC14保守结构域.S0ec14p磷脂酰肌醇转运蛋白广泛存在于真核生物细胞中,并参与膜运输途径、质膜发育、脂肪酸代谢、根毛的生长等生命活动,但未见此蛋白在作物逆境胁迫的有关报道.为研究Sec14p基因在小麦(Triticum aestivum)发育及逆境胁迫中的功能,本研究采用电子克隆方法从小麦京花9号中得到一个Sec14p基因,命名为TaSEC14p-5 (GenBank登录号:KU639968).氨基酸序列分析表明,该基因ORF全长为984 bp,编码327个氨基酸,相对分子质量为37.1 kD,理论等电点为7.70.在植物中该蛋白有典型的SEC14类基因家族保守域SEC14和一个CRAL_TRIO_N结构域.进化和聚类分析表明,小麦TaSEC14p-5基因与粗山羊草(Aegilops tauschii)磷脂酰肌醇转运蛋白AeSEC14p基因和水稻(Oryza sativa)磷脂酰肌醇转运蛋白Os02g0200000基因亲缘关系较近,蛋白相似度分别为96.45％和88.38％.采用qRT-PCR技术,对小麦孕穗期不同组织和不同非生物胁迫幼苗进行表达分析.发现该基因在根、茎、叶、颖壳、雄蕊和种子中均有表达,且在茎中表达量较高,雄蕊次之,根最低;该基因受高盐的强烈诱导,同时也受到脱落酸(abscisic acid,ABA) (200μmol/L)、干旱(PEG6000)和低温(4℃)不同程度的胁迫诱导.TaSEC14p-5在NaC1、ABA、PEG和4 ℃四种不同胁迫处理下,总体趋势为先上升后下降.结果推测,TaSEC14p-5基因可能参与了NaC1、ABA、PEG6000和4℃等不同程度的非生物胁迫处理,为进一步改良小麦抗逆性等分子机理研究提供了新的依据.     

激发子隐地蛋白基因介导的烟草抗病性研究

摘要：从隐地疫霉（Phytophthora cryptogea）中克隆cryptogein（Crypt）激发子基因。针对病原菌侵染和Crypt基因的特点，选用能在根、茎、叶等的表皮细胞中特异性表达的、弱组成型并受病原菌诱导的水稻(Oryza sativa )苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的启动子；同时为了使表达的cryptogein蛋白能分泌到细胞外，更好地与植物细胞膜受体互作，在Crypt基因前还融合了病程相关蛋白PR1b的信号肽; 然后将此融合基因构建于植物表达载体CHF3中。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefancens)介导的叶盘转化法转入烟草(Nicotiana tabacum )。经卡那霉素抗性筛选获22株再生植株，PCR检测都为阳性，部分植株的Southern杂交结果表明,Crypt基因已以低拷贝（1～2个）整合到烟草基因组中。抗病性测定结果表明,转化植株对烟草黑胫病菌(P. parasitica var. nicotianae )、赤星病菌(Alternaria alternata )和野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci )的抗性均有提高。     

胚柄特异性表达顺式元件结合蛋白酵母单杂交文库的构建

旨在构建酵母单杂交文库用于筛选与胚柄特异基因G564启动子顺式元件结合的转录因子。本研究根据植物胚柄特异表达基因G564启动子关键序列(GAAAAGCGAA)合成了5次串联重复序列,并与报告质粒pHIS2.1连接构建诱饵载体pHIS2.1-G564-5A;以纯化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼嫩种子mRNA为模板,合成SMARTTMⅢ和CDSⅢ锚定末端dscDNA;并将dscDNA与线性化融合表达载体pGADT7-Rec2以及诱饵载体pHIS2.1-G564-5A共转化到酵母Y187,构建酵母单杂交文库。文库的共转化效率为5.53×105cfu/μg。对文库中的阳性克隆进行测序,获得117条可读序列。对其进行基因功能注释并进一步分析基因的功能发现,具有DNA结合功能的蛋白14个,具有蛋白质结合功能的蛋白8个。上述22个蛋白包括TATA结合蛋白1(TBP1),支架结构相关区(SAR)DNA-结合蛋白,胚珠发育蛋白,G-box结合因子1(GBF1),组蛋白H3等。本研究为分离和克隆胚柄中特异表达的转录因子提供了候选基因。     

水稻psb A启动子诱导的GUS基因在烟草叶绿体中的瞬间表达

利用水稻ｐｓｂＡ基因的启动子与ＧＵＳ基因融合构成叶绿体瞬间表达载体ｐＲＧ６，通过基因枪法将该质粒导入烟草叶片细胞叶绿体中，得到ＧＵＳ基因的瞬间表达。ＧＵＳ反应产生的监色沉淀局限于细胞内某一特写区域，而在核质表达载体ｐＢＩ１２１转化的细胞中蓝色沉淀分布于整个细胞质中。实验表明单子叶植物叶绿体水稻ｐｓｂ Ａ基因的启动子可以十分有效地在双子叶植物烟草细胞叶绿体中起作用，在观察时采用了植物组织切片中的二甲     

棕色棉GhANS基因的克隆与表达分析

本研究以15DPA棕色棉及其白色近等基因系为材料,蛋白质双向凝胶电泳结合质谱分析,鉴定出其中一个差异表达的蛋白为花色素合成酶(ANS)。以15DPA棕色棉纤维细胞cDNA为模板,电子克隆获得了编码该蛋白基因的全长cDNA序列,序列分析发现,该基因的开放阅读框为1062 bp,编码354个氨基酸,属于花色素还原酶2-酮戊二酸加氧酶亚家族,将该基因命名为GhANS。构建GhANS基因GFP融合植物表达载体转化烟草,荧光共聚焦显微镜观察发现GhANS基因定位于烟草细胞质内。实时荧光定量PCR分析表明,GhANS基因在棉花中组成型表达,该基因在纤维细胞发育的各个时期在棕色棉中表达量均高于其白色近等基因系,推测GhANS基因在棕色棉纤维色素合成过程中起重要作用。     

雷竹SEP-like基因的克隆及功能分析

为探究竹类植物中SEP-like基因的功能,利用同源克隆方法从雷竹中克隆出1个SEP-like基因,命名为Pv MADS5。该基因的开放阅读框为687bp,可编码228个氨基酸。同源比对与系统进化树分析表明,该蛋白与箭竹、毛竹、麻竹SEP类蛋白同源,同属于禾本科Os MADS5亚类。实时荧光定量PCR结果表明,Pv MADS5在开花和不开花雷竹中的幼叶、老叶、秆、竹笋及花中均有表达;亚细胞定位表明Pv MADS5是核蛋白。在拟南芥中过表达Pv MADS5,转基因植株比野生型开花晚并且莲座叶变小,表明Pv MADS5可能是开花抑制基因且参与叶的发育。本研究为揭示竹子开花的分子机制提供了理论依据。     

应用酵母双杂交系统筛选与CASTOR相互作用的蛋白

CASTOR编码百脉根中的离子通道蛋白，它是共生途径上的功能基因，作用于结瘤因子诱导产生的钙离子激增（calcium spiking）信号转导途径的上游，突变后不能形成根瘤。为了进一步揭示CASTOR调控共生信号途径的分子机制，本文通过酵母双杂交系统在百脉根的cDNA文库中筛选可能与CASTOR相互作用的蛋白，以酵母配合的方法初筛获得111个阳性克隆，经β- Gal检测进一步确认有99个蓝色克隆子，测序以及NCBI BLAST比对分析鉴定出JAB1、CLPA、钙调素结合的翻译延伸因子等7种可能与CASTOR相互作用的蛋白，利用RT-PCR方法检测了这些基因在接种以及不接种根瘤菌的百脉根中的表达水平，分析推测CASTOR可能与上述蛋白形成复合物参与共生信号的转导。