金龙胆草查尔酮合酶基因(CHS)的克隆及其在花期不同组织的表达量分析

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是植物类黄酮化合物合成的第一关键酶。为了获得金龙胆草(Conyza blinii Lévl.)CHS基因,本研究采用快速扩增cDNA末端(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆得到了金龙胆草CHS基因的DNA和cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,通过RTPCR检测该基因在花期不同组织部位中的表达情况并检测对应部位的相对花青素含量。结果表明,获得的CHS基因DNA全长2 098 bp,包括2个内含子;cDNA全长为1 692 bp,含有完整开放阅读框(1 197 bp),编码399个氨基酸,包含查尔酮合酶的标志性序列,命名为CbCHS(GenBank登录号:KJ155749)。序列比对结果显示,金龙胆草CbCHS基因与已报道的其它植物的CHS氨基酸序列具有很高相似性(最高为95%)。半定量RT-PCR结果显示,在叶和茎的表达量最高,相对表达量分别达到87.03%和98.33%,表达量之间没有显著差异(P0.05);在根中CbCHS基因表达量最少,相对表达量仅为9.43%,表达量与其余部位具有显著差异(P0.05)。花青素含量也以茎和叶中最高,根中微量,表明CbCHS基因与花青素的蓄积有一定相关性。本研究首次克隆了金龙胆草CbCHS基因的全长DNA及cDNA序列,研究了其在花期不同组织器官中的表达量差异及与花青素的含量关系,为进一步研究CbCHS基因对金龙胆草黄酮含量的影响及其调控机制提供了基础资料。     

高邮鸭TNNI1基因克隆及组织表达分析

慢速骨骼肌型肌钙蛋白(slow skeletal muscle troponin I 1,ss TNI,TNNI1)基因主要定位于慢收缩骨骼肌肌纤维,在肌肉发育中具有重要的作用。本研究旨在克隆高邮鸭(Anas platyrhynchos)TNNI1基因并分析其在不同组织中的表达规律。以高邮鸭为实验材料,利用5′和3′cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cDNA ends,RACE)技术,克隆TNNI1基因全长cDNA序列并进行同源性分析;利用荧光定量PCR技术,检测TNNI1基因在70日龄高邮鸭不同组织中的表达差异和不同发育阶段肌肉组织中的表达规律。结果表明,TNNI1基因全长cDNA序列为965 bp,包括56 bp的5′UTR,345 bp的3′UTR和564 bp的ORF,编码187个氨基酸(Gen Bank登录号:KY926794)。序列同源性分析发现,与北京鸭、鹌鹑(Coturnix japonica)、鸡(Gallus gallus)和哺乳动物TNNI1基因的同源性分别为97.9%、97.9%、97.3%和87.7%。系统进化树分析表明,高邮鸭与鹌鹑和鸡的亲缘关系最近,与哺乳动物亲缘关系较远。荧光定量PCR结果表明,TNNI1基因在本实验各个组织中均有表达,其中腿肌表达量最高,极显著高于其他组织(P0.01);其次是心脏、肺、胸肌、腺胃、肾脏和十二指肠组织;而大脑、肝脏、脾脏和下丘脑中表达量最低。21胚龄胸肌TNNI1基因表达量极显著高于腿肌(P0.01),其他发育阶段均是腿肌表达量显著高于胸肌(P0.05)。高邮鸭TNNI1基因结构与组织表达特征的研究结果,为进一步研究TNNI1基因在鸭肌肉发育中的作用机制提供了基础资料。     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定

根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。     

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3＇-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1（GenBank登录号为HQ225758）。该基因开放阅读框...     

花生二氢黄酮醇还原酶基因(DFR)的克隆及表达分析

二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是植物花青素合成过程中的关键酶,催化二氢黄酮醇生成无色花青素。本研究利用花生(Arachis hypogae a L.)未成熟种子cDNA文库,通过大规模EST测序,从花生中克隆了DFR基因的全长cDNA序列。序列分析表明,花生DFR蛋白氨基酸序列与其他植物来源的DFR有很高的同源性。利用花生cDNA芯片和半定量RT-PCR方法对花生DFR基因表达模式的研究发现,DFR基因在果针中表达水平最高,其次是花,在根和叶中有微量表达;不同种皮颜色花生品种的种子中表达差异明显,随种皮颜色的加深,DFR基因表达增强,在中花9号黑色种子中表达量最高。对茎叶紫色花生种质材料的研究表明,在紫色组织中DFR基因表达较强。结果表明DFR表达量与花青素积累量呈正相关,说明DFR催化反应是花青素合成途径的关键步骤。     

刺参核糖体蛋白L17基因(RPL17)全长cDNA克隆及组织表达

核糖体蛋白除组成核糖体、参与蛋白质合成之外,还作用于细胞的分裂、增殖、分化、凋亡、发育调控等过程.为了研究核糖体蛋白基因在刺参中的生理功能,本研究采用全长cDNA克隆技术首次从刺参(Apostichopus japonicus)体壁中克隆出核糖体蛋白L17基因(ribosomal protein L 17,RPL17)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JQ922561).该基因cDNA全长643 bp,包括33 bp的5’-UTR,58 bp的3’-UTR,开放阅读框552 bp,编码183个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为21.5010kD,理论等电点(pI)为10.29,总平均亲水性(GRAVY)为-0.964,为不稳定的亲水蛋白.在NCBI网站上经Blastn和Blastx比对分析,发现该序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与其他物种的同源性均在70％以上,其中与紫海胆(Stron-gylocentrotus purpuratus)的同源性分别为75％和81％.二级结构预测结果:α螺旋占36.61％;β折叠占7.65％;无规卷曲占42.08％;其余13.66％为延伸链.蛋白功能位点分析显示其含有1个核糖体蛋白L22信号位点和9个磷酸化位点,其中cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点3个,蛋白激酶C磷酸化位点4个,酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点2个.构建的系统进化树显示,刺参与同为棘皮动物的紫海胆聚为一支,分子进化地位上关系最近,其次聚类顺序较近的为玻璃海鞘、非洲爪蟾,脊椎动物聚为一支,该结果与这些物种在生物学上的分类是较一致的.利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测RPL17基因在刺参各组织中的表达,结果表明,RPL17基因在体腔细胞中表达量最高,肠中次之,呼吸树中最低.体腔细胞中的表达量分别为肠、体壁、纵肌、呼吸树的5.67、21.63、43.25和346倍,与4种组织的差异均极显著(P＜0.01).另外,肠与呼吸树中的表达量差异显著(P＜0.05),其余组织差异不显著(P＞0.05).本研究结果将为进一步研究刺参蛋白质合成、再生及多种生理活动的调控机制提供基础数据.     

桃MPK3基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究MPK3响应GA信号调控休眠解除的分子机理,以中油四号油桃为试验材料,通过实时荧光定量PCR发现GA诱导下MAPKs家族基因在桃芽中有不同程度的表达,其中PpMPK3响应GA正调控表现最强烈。利用MEGA6.0、MEME、GSDS、DNAMAN 6.0等软件对桃PpMPK3基因进行生物信息学分析,结果表明,PpMPK3的cDNA全长1 113 bp,编码370个氨基酸,蛋白分子量约为42.6 kD,理论等电点为5.62,属于亲水性不稳定蛋白。预测PpMPK3蛋白发生磷酸化修饰的位点有45个,不存在糖基化位点。PpMPK3蛋白的二级结构中α-螺旋占41.35%,延伸链占10.54%,无规则卷曲为48.11%。进化树分析表明,PpMPK3氨基酸序列与甜樱桃亲缘关系最近,同源性为99.73%。通过亚细胞定位发现,PpMPK3定位于细胞核。RT-PCR结果表明,PpMPK3的表达模式与休眠解除过程相一致,推测PpMPK3能够响应GA信号,促进休眠解除。本研究结果为桃设施栽培的休眠调控提供了一定的理论依据。     

蜡梅nsLTPs基因家族3个成员的分子特征及非生物胁迫应答分析

为了探索脂转移蛋白在蜡梅开花抗寒性形成方面的可能功能,在构建蜡梅花cDNA文库及 EST分析的基础上,通过对文库cDNA克隆全长测序 ,得到了3个蜡梅非特异性脂转移蛋白的基因,分别命名为CpLTPI.1,CpLTPI.2,CpLTPI.3。它们的cDNA全长分别为611 bp,1016 bp和656bp ,ORF大小基本一致,分别为360bp,360bp和351bp,但 5′端和3′端的非翻译区的长度不等,存在的调控基序有所不同。3个基因的编码蛋白均具有植物非特异性脂转移蛋白的典型结构,即4对二硫键,4个ɑ-螺旋,有一个可结合和容纳脂肪酸分子的类似口袋状的疏水结构,分子量约为9 kD,为nsLTPI类。实时荧光定量PCR技术分析比较蜡梅叶片中 3个基因对非生物胁迫的应答情况,结果表明3个nsLTP基因在蜡梅幼苗中的表达受干旱、ABA、低温和NaCl处理的影响程度不同,表明这些基因可能在蜡梅幼苗的水分平衡、耐受低温、离子代谢等过程中发挥着不同的作用。     

结球甘蓝BoFBX117基因的克隆与表达分析

F-box基因在植物组织器官发育及非生物胁迫响应中起着重要的作用。为进一步探讨其作用机制,从结球甘蓝品种BoJF-16-1中利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆得到一个F-box基因BoFBX117,其cDNA全长为936 bp,编码311个氨基酸,蛋白分子量为30.14 kDa,等电点为9.71。该基因编码BoFBP7蛋白,序列同源性分析表明,BoFBP7与芜菁、萝卜、拟南芥的FBP7蛋白亲缘关系较近,同源性分别为99.36%、98.39%、92.26%;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析表明,BoFBX117基因在结球甘蓝莲座叶中最高,其次是根,幼叶中表达量最低,表现出组织特异性;在低温胁迫处理下,该基因表达量总体呈现上升趋势,说明该基因的表达受低温胁迫诱导。推测BoFBX117基因可能在结球甘蓝叶片发育及低温胁迫中发挥重要的生物学功能。本研究为深入解析F-box基因调控植物生长发育及非生物逆境胁迫的分子机制提供了依据。     

金柑磷酸蔗糖磷酸酶的基因克隆、表达与蛋白结构分析

磷酸蔗糖磷酸酶（SPP）是植物蔗糖生物合成最后一步催化反应的关键酶，对调控植物生长发育不同时期的蔗糖合成过程有重要作用。为探索金柑（Fortunella crassifiolia Swingle）SPP基因及其编码蛋白的序列特征及其在果实发育过程的表达特性，本研究以四倍体品种脆蜜金柑（F. crassifiolia Swingle cv. Cuimi）为试验材料，采用反转录PCR和cDNA末端快速克隆（RACE）方法从金柑果肉中克隆SPP基因，对其进行生物信息学和原核表达分析，并检测果实发育不同时期该基因在果肉中的表达量。结果表明，FcSPP基因的cDNA序列全长1 638 bp，最长开放阅读框（ORF）为1 191 bp，编码396个氨基酸，理论等电点为6.57，为稳定的亲水性蛋白，二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。FcSPP蛋白含有S6PP和S6PP＿C保守结构域，属于植物磷酸蔗糖磷酸酶家族成员。系统进化分析结果显示，FcSPP蛋白与甜橙SPP同源性最高，在进化树上与拟南芥等双子叶植物SPP划归为一类。此外，本研究构建了FcSPP基因的原核表达载体，诱导表达获得纯化的FcSP...     

氮素诱导的甜菜gln2的克隆及序列分析

本文探索了在氮素诱导下,甜菜gln2序列变化情况及氮素对gln2的调控表达情况。根据已知甜菜谷氨酰胺合成酶基因(gln2,登录号为AY026353)设计特异引物,利用RT-PCR方法克隆甜菜质体型谷氨酰胺合成酶的cDNA(GS2 cDNA)片段和甜菜质体型谷氨酰胺合成酶基因组DNA(GS2 DNA)序列,并进行生物信息学分析。获得甜菜GS2 cDNA片段序列,并首次得到甜菜GS2 DNA序列,并将GS2DNA登录到了NCBI网站的GenBank(登录号为EU558132)。生物信息学分析结果表明,GS2 DNA长度为6 144bp,含有13个外显子和12个内含子;氮素诱导的GS2 cDNA序列长度为1 296bp,与gln2序列相似性达99.92%,可编码431个氨基酸残基;其氨基酸序列与其它植物的质体型谷氨酰胺合成酶(GS2)有很高的同源性,与菠菜GS2的同源性最高,属于混合型蛋白,具有Gln-synt保守功能域,N端为beta-Grasp domain,C端为catalytic domain。采用半定量PCR分析该基因在氮素处理下的诱导表达情况,结果表明,NO3-N∶NH4+-N=80∶20和NO3-N∶NH4+-N=50∶50的处理对GS2基因表达的促进效果最好,NO3-N∶NH4+-N=0∶100对GS基因诱导作用最差。研究甜菜GS基因的结构功能及表达调控对甜菜实现高同化氨及增产增糖有重要意义。     

GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化

摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。     

草莓半胱氨酸蛋白酶基因(FaCP)的克隆及表达分析

半胱氨酸蛋白酶作为一种重要的水解蛋白酶,参与植物的许多生理过程.采用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria×ananassa)中克隆到半胱氨酸蛋白酶基因FaCP (GenBank登录号:JN979371),该基因cDNA全长1 338 bp,包含一个1 062 bp完整的开放阅读框(ORF),编码354氨基酸.生物信息学序列分析表明,FaCP开放阅读框编码的氨基酸序列与其他植物的CP蛋白同源性较高.Real-time PCR分析发现,FaCP基因在草莓果实、叶、根、茎和花萼中都有表达;在果实成熟过程中FaCP表达量逐渐增加,在粉红果最高,红果中略有下降.在草莓叶片中,随着叶片衰老,FaCP基因表达量增加明显.研究结果表明,FaCP可能参与了调控草莓果实的成熟及叶片衰老.     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

巴西橡胶树K~＋通道蛋白基因HbKCO1的克隆与表达分析

本研究采用RT-PCR结合RACE技术,成功地克隆了一个新的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因并分析了其结构和表达特征.结果表明,该基因cDNA全长1482 bp,拥有1059 bp的开放阅读框(ORE),编码353个氨基酸残基.同源性和聚类分析证实,该基因属于植物KCO家族,命名为HbKCO1(GenBank登录号为EU827609).半定量RT-PCR分析结果显示,HbKCOl在巴西橡胶树不同器官中均有表达,但叶片中表达量最高,茎次之,根、胶乳和树皮中的表达量最低;高钾、盐胁迫(NaC1)和Ca~(2+)可以促进叶片中HbKCOl的表达,钾饥饿和ABA则起到抑制作用;胶乳中HbKCOl的表达几乎不受乙烯利(ET)和茉莉酸(JA)的影响.     

草地螟中肠肉碱-脂酰肉碱转位酶基因(LstiSLC25)的克隆及表达

利用甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)围食膜多克隆抗体免疫筛选草螟(Loxostege sticticalis)中肠cDNA表达文库,得到编码肉碱-脂酰肉碱转位酶(LstiSLC25)基因的全长cDNA克隆.该cDNA克隆全长1 474 bp(GenBank登录号EU924506),开放阅读框长897 bp,编码299个氨基酸,预测分子量和等电点分别为32.1 kD和9.46.序列含有3个典型的溶质运转重复结构,具有溶质运载蛋白家族的典型特征.将该基因与pET30载体重组后,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli获得了表达.     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达分析

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛的HCRTR1基因编码区全长,获得1278 bp编码区全长序列,将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%。提取阳性克隆的质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后,回收到1278 bp的目的片段,定向克隆到pET32a（+）表达载体上,连接产物转化Bl21(DE3)感受态大肠杆菌,对长出的菌落进行菌落PCR和质粒酶切鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE表明秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中不表达,生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,可能是此类蛋白在原核系统的表达将会影响细菌本身存活,因此原核表达系统也成为研究此类蛋白的瓶颈。     

牡丹PsMADS5基因的克隆、表达及载体构建

以牡丹品种赵粉（Paeonia suffruticosa L.cv.Zhao Fen）为试材,采用RT-PCR和RACE法从花瓣中获得了1个牡丹SEPALLATA基因cDNA,命名为PsMADS5,GenBank登录号为HQ449569。其cDNA全长1222bp,包含190bp的5＇非编码区、302bp的3＇非编码区...     

小金海棠S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（MxSAMS）的克隆和表达分析

从本实验室建立的小金海棠缺铁差减文库中分离出一个cDNA片段,在GenBank中发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因具有90%的同源性。利用RACE技术成功地获得小金海棠（Malus xiaojinensis）SAMS基因(MxSAMS)的cDNA全长序列（GenBank登录号：EU639408）,该基因cDNA全长1 479 bp,最大开放阅读框1 176 bp,编码392个氨基酸,酶蛋白理论分子量为42.99 kD;与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在88.1%~92.6%之间。推测的MxSAMS蛋白质三级结构包含3个保守结构域和一个保守的ATP结合位点GAGDQG。Southern 杂交显示,MxSAMS基因在小金海棠基因组中是单拷贝的。半定量RT-PCR结果表明,该基因在小金海棠的根和叶中均受缺铁胁迫诱导增强表达。