牛巴贝斯虫新疆株MSA-2c基因重组质粒的构建、真核表达及其免疫反应性研究

根据GenBank公布的牛巴贝斯虫裂殖子表面抗原MSA-2c基因序列设计引物,采用PCR方法从患病牛的全血基因组中扩增得到798 bp的MSA-2c基因片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达MSA-2c基因,取其肝脏提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增可得到目的条带;用重组质粒pcDNA3.1( )-MSA-2c肌肉注射免疫小白鼠4次后,将获得的抗血清作为抗体,纯化的GST-MSA-2c融合蛋白作为抗原进行Western-blot检测,可得到抗原-抗体结合产生的特异性条带,表明重组质粒具有免疫学活性.     

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白抗象间接ELISA检测方法的初步建立

以纯化的牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测牛巴贝斯虫血清特异性抗体的间接ELISA方法。方阵试验确定的GST-MSA-2C抗原的最适包被浓度为2.5μg／mL,血清最佳稀释倍数为20倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10％。经对多例血清检测表明,所建ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。     

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的初步建立

以纯化的牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测牛巴贝斯虫血清特异性抗体的间接ELISA方法.方阵试验确定的GST-MSA-2C抗原的最适包被浓度为2.5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为20倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%.经对多例血清检测表明,所建ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.     

新疆牛巴贝斯虫病的流行病学调查

[目的]2006～2008年对全疆14个地州的牛巴贝斯虫病进行流行病学调查.[方法]使用已建立的牛巴贝斯虫病间接ELISA检测方法,以纯化的重组蛋白GST - MSA -2作为抗原.[结果](1)新疆存在着牛巴贝斯虫病.在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清7份,感染率为2.52;.在2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清32份,感染率为3.13;.在2008年的530份牛血清中检出阳性血清43份,感染率为5.28;.(2)2008年在地方流行性疫病区牛巴贝斯虫感染率高达28;.(3)牛巴贝斯虫病所在的地州由2006年的5个扩大到2008年的11个.[结论]新疆牛巴贝斯虫病的感染率逐年上升,疫区面积不断扩大,流行区内感染率激增,牛巴贝斯虫病的防治不容忽视.这是新疆首次利用血清学方法对全疆牛巴贝斯虫病进行大规模的流行病学调查.     

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学诊断方法的建立

[目的与方法]在优化表达牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白和建立ELISA反应条件的基础上,进-步探讨牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白及其所建立的ELISA检测方法的特异性,从而建立牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学检测方法.[结果]牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA检测方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]所建立的GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学检测方法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白抗原建立的牛巴贝斯病血清学诊断方法,为大规模地进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

牛巴贝斯虫DXS基因的克隆和真核表达

【目的】顶质体是存在于包括疟原虫和巴贝斯虫在内的顶复门寄生虫的一种细胞器,在病原体中,它主要承载类异戊二烯前体和脂肪酸合成途径,异戊二烯五碳结构是有机体合成多种化合物的结构基础,对有机体生命活动至关重要,例如,在哺乳动物中成为胆固醇和类固醇激素的基本结构,在植物中参与合成类胡萝卜素。且存在于顶质体的类异戊二烯前体合成途径对于病原体的生命活动至关重要且不存在于人类和哺乳动物机体,这使其成为近年来人们研究抗原虫药物的焦点。有学者发现利用特异性阻断类异戊二烯代谢途径的药物可治疗疟疾。1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶（DXS）为该途径中的第一个限速酶。因此,针对牛巴贝斯虫的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶dxs基因进行克隆和序列分析,并对其进行真核表达和活性检测,以期获得具有活性的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶,为进行针对该酶的特异性抑制剂的筛选奠定基础。【方法】首先采用反转录PCR技术从牛巴贝斯虫陕县株总RNA中扩增出DXS基因的全长cDNA,并对其进行克隆测序,对测序结果进行序列分析,将阳性克隆亚克隆至带荧光标签的真核表达载体,利用脂质体转染法将重组真核表达质粒转染至Hela细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染细胞的表达情况,消化收集转染细胞,通过超声破碎后采用Western blot技术对DXS蛋白的表达情况进行检测,结合G418压力筛选以及有限稀释的方法对转染阳性细胞进行筛选,获得阳性单克隆细胞。在体外建立DXS酶反应体系,并利用液相质谱联用技术对表达产物的体外活性进行检测。【结果】扩增得到的DXS基因全长共2 061 bp,共编码686个氨基酸,与GenBank上T2Bo株相应基因相似性达到98.0%。利用生物信息学方法对该蛋白质的二级结构进行分析发现,该酶具有3个结构域,分别是焦磷酸硫胺素结合区域;焦磷酸硫胺素嘧啶环结合区域;转酮醇酶C端区域,该酶属于常见的TPP依赖蛋白酶家族。通过倒置荧光显微镜观察,转染重组质粒后的Hela细胞呈现绿色荧光,Western blotting结果显示融合绿色荧光蛋白的DXS酶大小约为102 kD,表明构建的真核表达重组质粒在Hela细胞中进行了正确的表达。通过结合G418加压和有限稀释法筛选得到稳定转染重组质粒PEGFG-DXS的阳性单克隆细胞。利用质谱技术检测到在细胞粗提物与反应混合物反应后的产物中有分子量与DOXP相同的产物存在,在阳离子模式下m/z=237,表明表达产物具有催化活性。【结论】成功的表达了具有活性的牛巴贝斯虫DXS酶,并对融合蛋白的活性进行了定性分析,为今后开展针对DXS酶的特异性化合物体外高通量筛选研究提供了材料。对研究针对DXS为靶标的抗原虫药物具有重要意义,为深入研究该酶的酶学性质和特异性抑制剂筛选奠定了基础。     

牛巴贝斯虫DXR酶的结构特征分析

利用反转录PCR方法扩增牛巴贝斯虫陕县株DXR基因,对其推导氨基酸序列进行生物信息学分析。研究牛巴贝斯虫DXR酶的结构,并探讨其是否可以作为磷胺霉素的作用靶点。结果表明：该基因编码框长度为1 152 bp,编码383个氨基酸,与NCBI上公布的美国牛巴贝斯T2Bo株DXR的相似性为97.4%。同源模建表明,DXR酶的三维结构同恶性疟原虫的三维结构相似,与磷胺霉素结合位点氨基酸具有保守性。     

二重PCR快速检测牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的研究

根据伊氏锥虫ITS序列（FJ416612）和GenBank报道的牛巴贝斯虫棒状结合蛋白1序列（FJ588013）,设计合成2对特异性诊断引物,建立了牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的二重PCR诊断方法。结果表明,建立的二重PCR诊断方法可扩增出牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的特异性条带,大小分别为213bp和360bp,最低检出量分别为4．00pg和0．38pg。但对牛双芽巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫、环形泰勒虫、附红细胞体、巴氏杆菌不敏感。用该二重PCR方法对95份水牛样品和134份奶牛样品进行检测,结果发现,水牛伊氏锥虫的感染率为13．7％（13／95）、牛巴贝斯虫的感染率为7．4％（7／95）,无混合感染;奶牛伊氏锥虫的感染率为3．7％（5／134）、牛巴贝斯虫的感染率为0（0／134）。说明该二重PCR方法具有敏感、快速、特异的特点,适用于牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的流行病学调查。     

湖北省水牛巴贝斯虫病调查研究(Ⅵ)——镰形扇头蜱体内牛巴贝斯虫虫样体的观察

人工感染牛巴贝斯虫的去脾脏水牛犊2头,当血液中出现巴贝斯虫体,染虫率达0.2%时,于一耳内放入饥饿成蜱,使之吸血。雌蜱吸饱血离休后,收集并分别放在28℃相27℃的恒温箱中,每隔24小时取蜱剪肢,涂片检查。发现置28℃的蜱在72小时,其血淋巴中出现虫样体,96—120小时,虫样体出现最多,144小时仍可见到。成熟的虫样体大小为12.0—15.0×1.8—3.5μm;置37℃的蜱其血淋巴中始终未能查到虫样体。     

牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白基因外显子的克隆与原核表达

从患牛焦虫病的牛全血样品中抽提总RNA,通过设计特异性引物,经RT-PCR扩增牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白20（HSP20）基因的外显子,将其插入pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体PGEX-4T-2-HSP20（exon）。试验结果显示牛双芽巴贝斯虫HSP20基因外显子已被成功克隆。该基因的外显子序列与国际标准株HSP20外显子的序列存在两个碱基的突变,导致其编码的蛋白质出现了一个氨基酸的变异。测序结果还表明,克隆出的牛双芽巴贝斯虫HSP20基因外显子已正向插入原核质粒表达载体PGEX-4T-2,成功构建了PGEX-4T-2-HSP20（exon）表达载体,并在大肠杆菌BL21（DE3）中的得到表达。     

牛结核分枝杆菌抗原蛋白Ag85B的表达及纳米疫苗的制备

以牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis,MTB)C68001株基因组DNA为模板,克隆免疫优势抗原基因Ag85B,构建重组表达质粒p ET-28a-ag85b,转化入大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。以明胶为佐剂,Ag85B为目的抗原制备纳米疫苗,并对其进行了相关的工艺检测。以BCA法建立测定蛋白质含量的标准曲线,在此基础上检测纳米疫苗的载药率和包封率。结果显示,明胶佐剂疫苗的载药率为71.83%,包封率为41.03%,符合纳米疫苗的工艺要求。     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。     

木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达

参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列,以引物拼接方式,人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA,插入pET-20b载体,获得重组表达载体pET-20b-xynA。重组菌在16℃下诱导效果最好,10 h酶活达到42.05 U/mL,重组酶占全细胞蛋白的47%,粗酶在65℃和pH 5～8条件下很稳定。     

莫氏巴贝斯虫滑动体组件蛋白基因gap45、gap50、myo A 和mlc的克隆表达与多克隆抗体制备

【目的】克隆和表达莫氏巴贝斯虫滑动体组件蛋白GAP45(gliding associated protein 45, GAP45)、GAP50(gliding associated protein 50,GAP50)、肌球蛋白A（Myosin A, Myo A）和肌球蛋白轻链（myosin light chain, MLC）基因及制备兔源性多克隆抗体。【方法】利用末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends, RACE）技术从莫氏巴贝斯虫裂殖子cDNA中扩增gap45、gap50、myo A及mlc基因,将获得的全长或基因的部分序列构建pGEX-4T-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）pLys中用IPTG诱导表达;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA测定抗体的效价及反应性。【结果】获得了gap45、gap50、myo A和mlc基因的全长分别为664、1391、773和2 538 bp,开放阅读框长度分别为567、1194、606和2 514 bp,制备的多克隆抗体具有较好的特异性,效价高于1:25 600。【结论】克隆了滑动体组件蛋白gap45、gap50、myo A和mlc基因的全长,并制备了多克隆抗体,为筛选巴贝斯虫疫苗和诊断用抗原和药物靶位、研究其生物学入侵机制奠定了基础。