狂犬病病毒核蛋白的原核表达及纯化

采用RT-PCR方法扩增出狂犬病病毒(RV)CVS株核蛋白(N)基因,并将目的基因亚克隆入原表达载体pET-28 a(+)中,经PCR、双酶切以及序列分析,结果表明:已成功构建了重组质粒.将重组质粒转化至大肠埃希氏菌Rossetta(DE3),在37℃,1 mmol/L IPTG条件下进行诱导表达.诱导产物经SDS-PAGE分析,在分子量约为54 KD附近出现较粗的目的带,与预期的目的蛋白分子量相符合.经表达条件优化,用1 mmol/LIPTG在37℃诱导表达5 h,表达量达到最高,Western-Blotting鉴定目的蛋白有较强的免疫原性.为狂犬病毒的N蛋白的新型疫苗的制备奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株M基因的原核表达与重组蛋白的复性研究

采用PCR方法从重组质柱pTG19-T-M扩增得到缺失N端疏水区序列的基因片段tM.将tM与原核表达载体pET-32a进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序.结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21细胞中成功地表达了醉繁殖与呼吸病毒重组蛋白pET-tM.表达量为31%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为29 kD的重组蛋白且以包涵体形式存在.8 mol·L~(-1)尿素变性溶解包涵体,再用稀释与透析相结合的方法对重组蛋白进行复性.复性蛋白经Western-blot检测,结果证明复性蛋白可被PRRSV阳性血清识别用.     

荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因克隆、原核表达及其抗菌活性分析

 【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT－PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180 bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS－PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BNBD12的成熟肽基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的21.4%;纯化的重组蛋白0.05 mg?mL-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果;扫描电镜观察发现重组蛋白作用后可引起病原菌内容物外泄而死亡。【结论】成功表达了荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素12,该重组蛋白既可作用于革兰氏阳性菌又可作用于革兰氏阴性菌,显示出较好的临床应用前景。     

Identification of profilin as a novel pollen allergen; IgE autoreactivity in sensitized individuals.

A complementary DNA encoding a pollen allergen from white birch (Betula verrucosa) that was isolated from a pollen complementary DNA library with serum immunoglobulin E from a birch pollen-allergic individual revealed significant sequence homology to profilins. The recombinant protein showed high affinity to poly-L-proline. Immunoglobulin E antibodies from allergic individuals bound to natural and recombinant birch profilin and also to human profilin. In addition, birch and human profilin induced histamine release from blood basophils of profilin-allergic individuals, but not of individuals sensitized to other plant allergens. The structural similarity of conserved proteins might therefore be responsible for maintaining immunoglobulin E antibody titers in type I allergy.     

山羊白细胞介素-18成熟蛋白的表达

 【目的】为了阐明重组蛋白的活性，置备具有生物学活性的重组白细胞介素18，应用于畜牧业生产。【方法】将含有山羊白细胞介素（gIL）-18基因的重组质粒pET-32a（+）在大肠杆菌BL21（DE3）中以1mmol•L-1 IPTG诱导4h或者更长时间进行表达。【结果】经SDS-PAGE试验检测到了gIL-18与pET载体融合表达的重组蛋白。以该重组蛋白与佐剂混合后，免疫小鼠制备多克隆血清。经Western-blotting 试验证实该重组蛋白具有免疫原性。经过包涵体变性、层析柱纯化和复性，证实该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性。这表明重组蛋白保留了天然蛋白大部分的生物学活性。另外，该重组蛋白还可以保护小鼠抵御PRV强毒的攻击。【结论】这为gIL-18作为免疫佐剂和免疫治疗剂的实际应用奠定了基础。     

重组小麦组蛋白H4介导绿色荧光蛋白基因(pEGFP/C1)的转染

利用在大肠杆菌体内表达的重组小麦组蛋白H4与质粒DNA形成复合体后,通过琼脂糖凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证重组蛋白与DNA的结合情况;MTT法检测蛋白对细胞的毒性作用;转染细胞后,激光共聚焦显微镜检测荧光蛋白的表达。此重组蛋白能很好地结合质粒DNA,且能有效地保护DNA分子不受核酸酶降解,并能高效地携带绿色荧光蛋白基因pEGFP/C1转染进入卵巢癌细胞株H08910。     

壳寡糖诱导的烟草Ser/Thr蛋白激酶的原核表达纯化及多克隆抗体的特异性检测

将壳寡糖诱导烟草中的一个Ser/Thr激酶OIPKL基因的C端部分定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG可诱导融合蛋白高效表达,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经纯化得到纯度较高的融合蛋白。用纯化的融合蛋白GST-OIPKLc免疫家兔,可得到抗血清anti-OIPK。anti-OIPK抗血清能特异识别原核系统表达的抗原以及烟草自身的抗原,对烟草中的OIPKL和OIPK蛋白具有高度的特异性。     

甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。     

鹅坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ的原核表达及免疫原性鉴定

【目的】明确鹅坦布苏病毒（GTUMV）E蛋白结构域I的原核表达及免疫原性,为进一步研究GTMUV E蛋白结构的生物学特性、免疫学功能等奠定基础。【方法】通过人工合成方法获得GTMUV E蛋白结构域I的编码基因（EI基因）,并与携带GST标签的p GEX-4t-1载体连接,转入大肠杆菌后经诱导表达获得融合蛋白,并以Western blotting鉴定融合蛋白是否有免疫原性。【结果】合成获得的E1基因片段为411 bp,将其插入p GEX-4t-1载体可构建重组表达质粒p GEX-4t-1-EI。阳性重组菌经1 mmol/L IPTG诱导5 h后,融合蛋白的表达量达最高峰,且以包涵体形式存在,分子量约41.0 k Da。Western blotting鉴定结果显示,融合蛋白与GST标签抗体和E蛋白阳性血清均可发生特异性反应,检测到预期的目的条带。【结论】GTMUV E蛋白结构域I可在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白具有良好的免疫原性,可用于GTMUV血清学检测试剂盒的研发。     

单核增生性李氏杆菌溶血素的原核表达及可溶性分析

对单核增生性李氏杆菌的主要毒力基因hlyA进行大肠杆菌原核表达,分析其表达蛋白的可溶性并纯化。根据hlyA基因设计特异性引物,细菌煮沸破裂提取基因组,PCR扩增出目的条带。连接转化至克隆载体pMD18-T,测序正确后连接表达载体pET-30a(+),酶切和PCR鉴定正确后转化至BL21(DE3),构建重组质粒pET-30a-hlyA。IPTG诱导表达蛋白,并分析其可溶性。PCR扩增的hlyA基因全长约1 600 bp,成功构建了重组质粒pET-30a-hlyA,转化大肠杆菌诱导表达了溶血素蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,结果显示表达的蛋白分子量约为60 kD,以可溶性和包涵体2种形式存在,且以可溶性为主要形式。成功克隆和表达了单核细胞增生性李氏杆菌hlyA基因和溶血素蛋白,并得到纯化蛋白。     

Bacterial Expression and Purification of an Active ω-Atracotoxin-Ar1b from Spider Atrax robustus

The ω-atracotoxin-Ar1b toxin(ω-ACTX-Ar1b)is one of the arthropod-selective peptide neurotoxins from the venom of Australian funnel-web spider Atrax robustus.The gene of Ar1b was synthesized and cloned into pET-32a(+)vector to allow expression of Ar1b as a fusion protein with thioredoxin and the His-tag(rTrx-Ar1b)in E.coli BL21(DE3).The optimal condition for inducing the expression of rTrx-Ar1b was 1.0 mmol L-1 IPTG for 6 h at 28℃.The fusion protein rTrx-Ar1b was expressed in soluble form and was purified effectively by His Trap HP affinity column and rpHLPC and a final yield of purified rTrx-Ar1b was 95 mg from 1000 mL E.coli culture.The LD50 values for Mythimna separate and Tenebrio molitor were 111.66 and 11.04 μg g-1 determined by injection of the purified rTrx-Ar1b.The results indicated that the recombinant Ar1b protein was successfully expressed in E.coli and it was high toxicity against tested insects.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp7蛋白的表达与纯化

为了解nsp7重组蛋白的免疫学活性,采用RT-PCR的方法从猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)BJ-4毒株中扩增得到nsp7基因,将基因连接到pET-28a载体并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,利用Ni-NTA进行亲和纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析和鉴定,通过间接ELISA方法研究了重组蛋白的免疫学活性。结果表明,成功制备了nsp7重组蛋白,间接ELISA结果表明,重组蛋白具有良好的免疫活性,为建立nsp7特异性抗体的间接ELSIA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

带有组氨酸标签的蛇毒基因在毕赤酵母中的表达

[目的]通过巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达带有组氨酸标签的蛇毒基因。[方法]利用基因重组技术,以海蛇基因为材料,通过PCR技术在N末端添加一个六聚组氨酸纯化标签,并将重组质粒导入菌株GS115,用1%甲醇诱导后,分泌表达了重组蛋白。[结果]测序结果显示该标签已成功插入,SDS-PAGE检测到分子量为28.5 kD的目的蛋白。[结论]成功表达了带有组氨酸标签的蛇毒蛋白,其具有良好的降纤活性。     

重组热带螨Blo t 21变应原诱导小鼠变态反应气道炎症模型的建立

为了建立热带螨重组变应原Blo t 21(rBlo t 21)诱导小鼠变态反应气道炎症模型,笔者利用从NCBI Gen Bank库里获得的热带螨Blo t 21基因序列,进行了序列优化与全基因合成,构建了原核表达载体PQE80LrBlo t 21,在大肠杆菌内诱导表达rBlo t 21,利用镍柱亲和层析纯化rBlo t 21蛋白。12只BALB/c小鼠随机分为对照组(PBS组)与诱导组(rBlo t 21组),每组6只,通过腹腔注射致敏与气道诱导后,分别通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清总IgE水平;鼠尾静脉注射变应原诱发应激性过敏反应;HE染色观察小鼠肺部炎症严重程度。本试验成功表达与纯化了重组热带螨变应原Blo t 21。利用纯化的rBlo t 21诱导小鼠变态反应气道炎症模型,与PBS组相比,rBlo t 21组的小鼠血清总IgE水平显著升高,肺部组织细胞侵润明显增加(P0.05)。原核表达纯化的重组Blo t 21变应原能够诱导小鼠产生变态反应气道炎症。     

鸡p15INK4B基因的克隆表达及纯化

为研究鸡p15INK4B蛋白的功能及为制备此蛋白的单克隆抗体提供材料,应用引物搭桥法合成p15INK4B基因,应用基因工程的手段构建p15INK4B基因的原核表达载体,在E.coliRosetta(DE3)菌进行融合表达,并对表达产物进行亲和层析纯化。结果成功地构建了p15INK4B基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物。     

猪囊尾蚴dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

【目的】克隆、表达猪囊尾蚴dUTPase基因并分析其酶学活性。【方法】通过RT-PCR的方法克隆猪囊尾蚴dUTPase基因,将其与pET载体连接并在原核系统中高效表达;表达产物经Ni柱纯化后进行酶学活性测定。【结果】序列分析表明猪囊尾蚴dUTPase基因与六钩蚴的dUTPase基因核苷酸同源性为100%,而且其氨基酸序列中同样存在5个保守基序。SDS-PAGE显示在21kD附近出现与目的蛋白大小相符的特异条带,表达产物经纯化后dUTPase的含量为2.863mg·mL-1。酶学活性试验证实重组dUTPase能特异性降解dUTP,同时EDTA可以抑制dUTPase的活性;而Mg2+可以增强猪囊尾蚴dUTPase的活性。【结论】成功克隆表达了猪囊尾蚴dUTPase基因并鉴定了它的酶学活性,为进一步研究dUTPase在猪囊尾蚴中的生物学功能奠定了基础,同时也为抗猪囊尾蚴病的药物设计和开发提供了研究基础。     

鸭β-防御素9基因的克隆、组织分布及其原核表达

 【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素9（AvBD9）基因,在原核表达重组鸭AvBD9蛋白;研究重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【方法】采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD9基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD9,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸭肝脏组织中克隆得到鸭AvBD9基因,序列分析表明该基因大小为204 bp,前体肽包括67个氨基酸残基。AvBD9基因在鸭体内广泛分布。SDS-PAGE电泳表明鸭AvBD9基因在大肠杆菌中高效表达,表达的重组鸭AvBD9融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约31 kD。重组鸭AvBD9蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性,在-70～100℃或pH 3～10处理30 min后仍有抗多杀性巴氏杆菌作用。【结论】鸭AvBD9基因为204 bp,编码67个氨基酸残基,在鸭组织中广泛分布。重组鸭AvBD9蛋白基因在大肠杆菌中高效表达,该重组蛋白具有广谱的抗菌活性,对温度和酸碱性有较高的稳定性。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白的原核表达

本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pet-32a-M在体外可以被成功表达.     

鸭leptin基因在大肠杆菌中的融合表达及生物学活性分析

 【目的】研究鸭leptin在体外高效表达特点，探讨表达产物的生物学活性及其功能。【方法】构建重组鸭leptin基因原核表达菌株，重组菌株经不同浓度IPTG和不同时间诱导后，对表达蛋白进行提取、纯化、复性和浓缩，经注射昆明小鼠后，对小鼠的体重﹑采食量和体脂含量进行分析。【结果】鸭leptin在大肠杆菌中实现了高效特异性融合表达，融合蛋白分子量约为20 kD，其中16 kD为鸭leptin基因表达产物，目的蛋白在0.2 mmol•L-1 IPTG的诱导下，表达量最高约占菌体总蛋白的57%。重组蛋白纯化﹑复性﹑浓缩后，能够明显降低小鼠摄食量、体重和体脂含量。【结论】鸭leptin基因在大肠杆菌中进行了高效融合表达，表达产物具有明显的生物学活性。     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。