OsMYB调控化感水稻酚酸类物质合成及其抑草作用

基因表达调控是水稻化感作用形成的重要基础。本研究对化感水稻PI312777(Oryza sativa L.)的Os MYB(CT829537)基因分别进行过表达(overexpression,OE)和RNA干扰(RNAi),再与稗草(Echinochloa crusgalli,BYG)共培养,以野生型PI312777为对照。结果发现,与稗草共培养下CT829537-OEPI312777的酚类代谢关键酶基因表达上调,根系及其水培液中的总酚酸浓度增加,抑草能力增强;相同处理下CT829537-RNAi PI312777则相反,其酚类代谢关键酶基因较野生型植株表达下调,总酚酸浓度降低,抑草能力下降。这表明Os MYB(CT829537)通过调节化感水稻的酚酸类物质合成进而影响其抑草能力。     

OsPAL2;3对水稻化感抑制稗草能力的调控作用

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase,PAL,EC4.3.1.5)是调控酚酸类化感物质合成的关键酶。PAL在水稻中为多基因家族,化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont中,相同PAL基因成员的启动子组成序列均存在差异,并以OsPAL2;3、OsPAL2;4基因启动子序列的差异最大,且PI321777的OsPAL2;3基因启动子的驱动活性高于Lemont。过表达OsPAL2;3基因,使PI312777和Lemont的抑草率分别提高11.11%和5.56%。过表达OsPAL2;3同时增强OsPAL2;3、OsC4H、OsCCA、OsCOL、OsOMT等基因的表达,增加水稻的原儿茶酸和香草酸含量。Co-IP结合质谱鉴定结果显示, OsPAL2;3蛋白与转酮醇酶、碳酸酐酶、果糖二磷酸醛缩酶、ATP合酶α亚基、ATP合酶β亚基等相互作用,调控水稻的苯丙氨酸代谢途径。本研究表明,OsPAL2;3的转录水平高低是P1312777和Lemont化感抑草能力差异的原因之一;OsPAL2;3与多个蛋白互作共同调控酚酸类化合物合成,该基因可用于提高水稻化感抑草能力的育...     

氮素胁迫下强、弱化感水稻萜类代谢途径中关键酶基因差异表达的FQ-PCR分析

运用实时荧光定量PCR技术研究低氮条件下化感与非化感水稻异戊二烯代谢途径中关键酶基因的表达差异。结果表明,与正常氮条件下相比,低氮条件下化感和非化感水稻与萜类物质合成相关的12个关键酶基因表达发生了不同程度的变化,其中,化感水稻PI312777有6个基因表达下调,6个基因则上调;而非化感水稻Lemont有7个基因表达下调,5个基因表达上调。在供氮条件从高向低改变的过程中,两水稻中有11个基因的表达行为（上调或下调）相同,从分子水平上,证实了它们萜类代谢相关基因在响应供氮环境变化的行为生态上是相同或相似的。低氮引起两水稻催化生成与化感物质相关的单萜、倍半萜、二萜、三萜类物质的合成酶基因表达量均显著下降,从而认为营养胁迫引起水稻化感抑草作用增强与萜类物质代谢变化无关。还讨论了营养胁迫引起萜类物质代谢变化与内源激素合成和生长速率减缓的关系,认为水稻甲羟戊酸代谢途径支路中3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA合酶、3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA还原酶和甲羟戊酸激酶相关基因表达量不同程度的上调,维持了生长所必需的激素水平。     

水稻化感品种抑草效应研究

以 PI 312777、丰华占和华粳籼1号为试验材料,研究了在大田抛秧种植条件下对伴生杂草的抑制效应.结果表明,PI 312777与丰华占表现有较强的抑草效应,而华粳籼1号表现不抑草;水稻化感品种的抑草效应主要表现在水稻生长前期,与水稻的化感潜力和水肥条件等方面有关.田间评价结果证明以特征次生物质为标记的方法可以较准确评价水稻品种化感潜力.     

水稻灌浆期叶鞘蛋白质差异表达分析

为研究叶鞘在籽粒灌浆期间代谢的分子机理, 应用差异蛋白质组学方法分析了大穗型水稻“金恢809”在籽粒灌浆不同时期, 叶鞘的蛋白质组变化趋势, 共检测到23个差异蛋白质点, 其中11个得到鉴定, 并按其表达丰度的变化分为6类。第1类, 随着灌浆进程表达量逐渐降低, 如α-亚基草酰乙酸脱羧酶; 第2类, 表达量先升后降, 如二磷酸核酮糖羧化酶小链和ADP-核糖基化因子１; 第3类, 表达量先降后升再降低, 如生长素响应因子、锌指-C3HC4型家族蛋白、液泡H+-ATP酶和二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活化酶; 第4类, 表达量先升后降再升又降, 如核酮糖α亚基结合蛋白; 第5类, 表达量先降后升, 如金属硫蛋白II相似蛋白-1A和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶; 第6类, 表达量逐渐升高, 如蛋白激酶家族蛋白。这6类蛋白分别参与叶鞘光合作用、激素调节、物质转运、植株衰老的抗性反应以及细胞信号转导, 共同调控叶鞘的源、库、流转化。     

毛白杨细胞色素C还原酶的基因克隆、表达和亚细胞定位

为克隆得到毛白杨CPR基因、成功在体外表达可溶性蛋白并通过构建GFP偶联载体观察其亚细胞定位,本研究通过RT-PCR的方法克隆得到了毛白杨CPR基因,登录号为MK575137。进一步通过生物信息学分析,发现毛白杨CPR与毛果杨CPR同源性最高,均有着典型的细胞色素C还原酶结构域。随后在酵母表达体系中表达该蛋白,验证了该蛋白不能被分泌表达,表明CPR蛋白为膜蛋白。进一步的亚细胞定位实验表明,CPR蛋白定位于内质网。CPR蛋白是P450单加氧化酶催化木质素合成的相关过程中必不可少的辅酶,该研究可为今后体外验证毛白杨P450单加氧化酶在木质素合成的相关过程中的酶活活性提供基础。     

大豆质核互作雄性不育系W931A及其保持系的差异蛋白质组学比较分析

采用SDS—PAGE与LC—MS／MS联用方法．对大豆质核互作雄性不育系W931A及其同型保持系W931B不同器官的蛋白质组进行比较性研究．结果发现不育系W931A与其保持系W931B种子和苗期叶片的蛋白质SDS—PAGE电泳图谱基本没有差异带．二胞花粉期花药SDS-PAGE图谱间有3条差异带。雄性不育基因表达具有时空和器官特异性,与育性有关的蛋白主要在花药中表达。对差异表达的蛋白如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、NBS—LRR疾病抵抗蛋白质的同源物、ATP合成酶b亚基、硫氧还蛋白过氧化物酶、类锌脂蛋白等进行功能分析．推测不育系W931A的雄性不育可能与淀粉合成受抑制、能量代谢紊乱和细胞凋亡有关。     

低温胁迫对水稻苗期根系影响的蛋白质组学研究

为了从蛋白质水平揭示水稻苗期响应低温胁迫的分子机理,以耐冷性强的东乡野生稻和冷敏感品种中嘉早17为材料,于5℃低温处理0,1,2,3 d后分别测定根系活力、过氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量等生理指标。随后利用iTRAQ技术对5℃低温处理3 d后水稻幼苗的根系差异蛋白质组进行分析。通过生理指标分析,5℃低温处理影响东乡野生稻和中嘉早17的根系生理指标,且在低温处理第3天,两者已出现明显差异。通过差异蛋白质组学分析,与常温(25℃)相比,东乡野生稻经低温处理后共鉴定到167个差异蛋白,其中,上调表达蛋白61个,下调表达蛋白106个;中嘉早17经低温处理后共鉴定到261个差异表达蛋白,其中,上调表达蛋白122个,下调表达蛋白139个。通过GO功能分析,这些差异蛋白质主要参与代谢、细胞和单机体过程,主要涉及细胞及细胞成分,主要起着结合和催化作用。通过KEGG分析,这些差异蛋白质主要参与代谢、次级代谢产物合成和碳代谢等代谢通路。通过对东乡野生稻和中嘉早17中均发生差异表达的29个蛋白质的进一步分析,了解到两者受低温危害后根系部分蛋白质的表达动态。本研究鉴定到的差异表达蛋白质为进一步阐述水稻耐冷机理及耐冷基因的挖掘提供理论依据。     

三种栽植方式下不同株型和化感特性水稻对无芒稗的干扰控制作用

以直播、小苗移栽和大苗移栽3种栽植方式为主处理,接种和不接种稗草为裂区处理,17份不同株型和化感特性水稻材料为再裂区处理,设计了对无芒稗干扰控制田间试验。结果表明,直播和小苗移栽对无芒稗株高、分蘖和干重有较好的抑制作用,优势株型和化感特性水稻对无芒稗具有较好的干扰控制作用。在30株 m^-2无芒稗的竞争干扰下,3种栽植方式间水稻产量差异不显著,杂草竞争干扰使水稻减产21.73%,化感作用水稻吓一跳、IR644-1-63-1-1、谷梅2号对稗草竞争力强,仍具一定产量水平。无芒稗竞争干扰对直播水稻株高、分蘖和植株干重影响大,与移栽水稻的差异显著。杂草干扰对供试水稻材料的农艺性状产生不同影响,水稻化感种质吓一跳中期分蘖强、植株高、干重大。无芒稗竞争干扰对成熟水稻株高无影响,但对分蘖、植株茎秆和穗干重差异显著。杂草竞争对3种种植方式的水稻千粒重无显著影响,但单株谷粒重以大苗移栽显著大于直播,移栽水稻的穗型较大,每穗总颖花数、每穗实粒数和结实率显著大于直播水稻。化感作用水稻谷梅2号、IR644-1-63-1-1、TN1和PI312777每穗颖花数不高、每穗实粒数少,化感作用水稻吓一跳每穗颖花数不高,但结实率高。水稻材料中早27、早籼浙207、早籼浙101、中早22等拥有较高的千粒重,化感作用水稻谷梅2号的千粒重显著高于IR644-1-63-1-1、TN1和PI312777。早籼浙101、早籼浙207和中早22等拥有较高的单株谷粒重,化感作用水稻中156的单株谷粒重显著高于谷梅2号、吓一跳、IR644-1-63-1-1、TN1和PI312777。     

化感水稻不育系‘化57S’田间抑制稗草能力表现评价

评价化感水稻不育系‘化57S’田间抑制稗草能力及稳定性表现及探究其在育种上的研究利用前景。以‘PI312777’和‘化感稻3号’为对照,分3期播种,对5个抑草性状及其稳定性表现进行分析。‘化57S’在3个播期中均表现出良好的抑制稗草能力,其灌浆期抑草率3个播期平均值介于对照‘PI312777’和‘化感稻3号’之间,且差异不显著,其余4个抑草性状在3个播期也均与对照差异不显著;‘化57S’灌浆期抑草率、稗草平均株高和稗草单株干物重3个抑草性状的稳定性均优于2个对照,其中灌浆期抑草率稳定性最好,变异系数仅为4.51%,可作为初步评价‘化57S’化感潜力的一个指标;相关性分析表明,化感作用和竞争作用共同决定化感稻田间整体抑草效果,化感作用主要是抑制稗草萌发,竞争作用既抑制影响稗草存活率又抑制存活稗草的生物量积累、但两者之间相关不明显。化感水稻不育系‘化57S’是一个田间抑制稗草能力较好且部分抑草性状稳定性好的化感稻材料,初步显示出具有良好的研究利用前景。     

水稻生育后期蛋白质组差异表达的图谱分析

从蛋白质组学角度对水稻生育后期的叶片蛋白质组变化进行了研究,利用Imagemaster 2D Elite 5.0软件对所得到的双向电泳图谱进行分析比较,以揭示水稻叶片蛋白质组的表达差异。结果表明,经图谱分析共得到差异蛋白质点47个,其中孕穗期及抽穗期新增蛋白质点6个,21个随生育进程表达丰度增加,6个蛋白质点表达丰度逐渐减弱,其它14个蛋白质点呈无规则变化,多表现为在某个生育时期具有峰值;蛋白质是细胞功能执行者,受细胞功能或细胞环境变化的影响,因此,上述蛋白质发生变化的原因可能与水稻后期的发育转变有关系     

赤霉素对盐胁迫抑制水稻种子萌发的缓解作用的蛋白质组分析

用粳稻日本晴(Oryza sativa L. cv.Nipponbare),研究了盐胁迫对水稻种子萌发的抑制作用和赤霉酸(GA₃)对盐胁迫的缓解作用;分别以H₂O (对照）,5 g L^-1 NaCl (处理I),5 g L^-1 NaCl + 100 μmol L^-1 GA₃(处理II)培养水稻种苗48 h,提取芽中的蛋白质,利用双向电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术分析了水稻蛋白质组的变化。结果表明,在盐胁迫条件下,日本晴种子的萌发显著受到抑制,而GA₃能显著缓解这种抑制作用;用ImageMaster软件分析2-DE凝胶,发现有4个蛋白质斑点表现出显著的变化,在盐胁迫下斑点S1、S2和S3表达下调而斑点S4消失,在GA₃与盐共处理时,这4个蛋白质点的表达均有不同程度的恢复;经MALDI-TOF MS分析,其中2个蛋白质斑点(S1,S3)分别被鉴定为isoflavone reductase-like蛋白与葡萄糖磷酸变位酶,这些蛋白可能与GA₃提高水稻耐盐性途径相关。     

胁迫相关蛋白激酶基因OsSAPK2调控水稻抗白叶枯病反应

水稻蔗糖非酵解型蛋白激酶Sn RK2,又称胁迫相关蛋白激酶(stress-activated protein kinase genes in rice,Os SAPKs),在调控水稻非生物胁迫信号传导中起着重要作用。本研究对Os SAPK2的结构及其在水稻抗白叶枯病反应中的功能进行了初步研究。结果表明Os SAPK2被定位于细胞核和细胞质内,与Os SAPK1、Os SAPK3同属于Kulik’s II组。Os SAPK2-RNAi转基因水稻中Os SAPK2下调表达,人工接种水稻白叶枯病菌后,转基因水稻比受体对照的病斑长度显著增长,抗病相关基因Os LRR1、Os HIR1表达水平下降,感病相关基因Os MAPK5表达水平升高。此外,Os SAPK2具有自激活活性,可能与Os MAPK5等胁迫相关蛋白互作。上述结果为进一步研究Os SAPK2调控水稻抗白叶枯病的分子机制提供了信息。     

水稻根系对1,2,4-三氯苯胁迫的应答

应用蛋白质组学、电镜观察、脂质过氧化物测定等方法研究了二个不同类型水稻品种的根系对有机污染物1,2,4-三氯苯（TCB）胁迫的应答。结果表明,TCB胁迫抑制水稻根系生长,影响根细胞结构,导致脂质过氧化。TCB胁迫对水稻根系蛋白质组也有显著影响。TCB胁迫能诱导根系内不同类型蛋白质的表达,它们是：解毒酶（包括脂酶、醛/酮还原酶、谷胱甘肽-硫转移酶）,细胞壁物质代谢相关酶（包括蛋白转葡萄糖基酶、GDP-甘露糖-3,5-异构酶1）,激素代谢或调节相关酶（包括酸式-还原酮二加氧酶、β-葡萄糖苷酶、病程相关蛋白家族10中的2个不同蛋白）,原初或次生代谢相关酶（包括转录延长因子、细胞质磷酸丙酮酸双激酶、磷酸丙糖异构酶、丙氨酸氨基转移酶和异黄酮还原酶）。TCB胁迫诱导矮仔占根系中β-葡萄糖苷酶和病程相关蛋白家族10蛋白的表达,及汕优63根系中谷胱甘肽-S-转移酶和酸式-还原酮二加氧酶的表达,这种诱导蛋白的差异可能是汕优63较矮仔占对TCB胁迫有较高耐性的机理之一。     

表油菜素内酯影响水稻幼苗响应低温胁迫的蛋白质组学分析

表油菜素内酯(2,4-Epibrassinolide, EBR)是一种被广泛研究和应用的油菜素内酯类(brassinosteroids, BRs)植物生长调节剂, 它能有效增强植物对低温的耐受性, 但EBR在蛋白质组水平上对水稻幼苗响应低温胁迫的影响尚不清楚。本研究用0.1 mg L ^-1 EBR和蒸馏水分别浸泡萌发的日本晴种子, 然后提取4°C胁迫培养和26°C正常培养幼苗的总蛋白, 进行质谱非标(label-free)定量分析和平行反应监测(parallel reaction monitoring, PRM)验证。最终共鉴定出5778个蛋白质, 其中, 在有定量信息的4834个蛋白中, 401个上调和220个下调蛋白与EBR影响水稻幼苗响应低温胁迫有关。功能分析和代谢通路富集分析发现, 上调蛋白主要与RNA结合或水解酶活性等分子功能相关, 并富集在碳代谢、叶酸合成和氨基酸生物合成等途径中; 下调蛋白主要与催化活性和氧化还原酶活性相关, 主要涉及卟啉和叶绿素代谢等代谢途径。PRM验证结果和文献证据显示, 分布在碳代谢和苯丙素代谢通路中的NADP-苹果酸酶、过氧化物酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶参与了EBR对低温胁迫水稻幼苗的调控, 提示BRs可通过多种途径影响水稻幼苗对低温胁迫的响应。     

6-BA对养分胁迫下水稻幼苗根系生长影响的蛋白质组学分析

为了揭示养分胁迫下6-BA维持水稻幼苗根系生长的分子机理,本研究采用蛋白组学分析技术,对养分胁迫下6-BA培养的水稻幼苗根系的蛋白质组差异表达进行比较分析。经过双向凝胶电泳分离,从水稻幼苗根系中获得20 个响应6-BA的差异表达蛋白质,其中14 个蛋白质得到质谱鉴定,这14 个蛋白质按其功能可以分为四大类：包括7 个参与呼吸代谢的蛋白质,4 个参与生长发育的蛋白质,2 个参与逆境胁迫的蛋白质以及1 个未知功能的蛋白质。分析结果表明,养分胁迫下,6-BA诱导了根系中参与呼吸代谢及生长发育相关蛋白质的表达量上调,增强根系的呼吸作用,促进根系的生长。     

适用于水稻微粒体蛋白的双向电泳技术及苯达松抗性相关蛋白的初步分析

针对不同来源的样品，建立相应的双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)技术是开展蛋白质组学研究的基础。以野生型水稻(O. sativa L.)农林8号(N8)及其苯达松敏感致死(bentazon sensitive lethal, bsl)突变体农林8号m (N8m)为材料，通过优化条件，建立了适合于水稻微粒体蛋白的双向电泳技术。并通过双向电泳图谱的比对，共找到15个差异蛋白点，分为供试材料间差异、苯达松处理前后差异和N8在苯达松处理后特异表达等3种类型。结合苯达松抗性比较及苯达松残留分析，推测材料间差异是因γ射线辐照引起基因结构变异，从而影响了基因的表达；苯达松处理前后差异与氧自由基清除酶系或系统获得抗性相关酶系有关；N8在苯达松处理后特异表达与苯达松代谢有关。     

云南抗白叶枯病稻种的RGA初析

根据水稻抗白叶枯病Xa21基因的富含亮氨酸重复区域（LRR）和番茄抗细菌性斑点病(Pseudomonas syringae pv. tomato)的Pto基因编码蛋白质激酶的DNA序列，设计2对引物用于扩增抗水稻白叶枯病品种中的抗病基因同源序列。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚类分析，结果表明供试抗病品种间具有丰富的RGA多态性，用同一引物测定的属于同一簇     

水稻CBB30Ⅰ抗白叶枯病相关基因的差异表达分析

水稻白叶枯病是水稻生产中最严重病害之一。前期鉴定发掘的水稻资源材料Y238对白叶枯病具有广谱抗性,其衍生的以IR24为遗传背景的基因导入系CBB30Ⅰ保持了广谱抗性。利用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建CBB30Ⅰ与感病品种IR24间的差异表达cD-NA文库,RT-PCR分析抗病相关基因表达情况。经反向Northern blot杂交检测、测序和GenBank中BLAST比对,结果共获得29个独立的差异表达cD-NA克隆,其中有3个功能未知基因。半定量RT-PCR进一步验证了抗感病品种间抗性相关基因的差异表达。根据MIPS(Munich Information Center forProtein Sequences)功能分类系统推测,这些差异表达基因可能参与了CBB30Ⅰ对病原菌的防卫反应、信号传导和蛋白合成与修饰等一些重要的生物学过程。