鸡β-防御素及其真核表达载体构建分析

本文介绍鸡β-防御素和研究现状,并对其真核表达栽体构建的可行性进行了可行性分析.     

防御素基因克隆和表达载体构建

人防御素(HNP)是一类广谱抗菌阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对于细菌、真菌乃至某些被膜病毒有广谱杀伤作用,是免疫系统中的重要组分。实验根据已发表的HNP-1cDNA序列,设计并合成了一对引物。以HL-60细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的片段并克隆到pUC18载体上,经筛选获得阳性重组子pUC18-HNP-1(pDFS1)。测序分析证实,扩增片段即为HNP-1cDNA。pDFS1再经SmaI与SalI酶切、插入pGEX-6p-1质粒构建HNP-1表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子最终获得pGEX-6p-1-HNP-1(pDFS2)重组质粒。     

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。     

鸡β- 防御素7 的克隆及表达

以NCBI已登录的鸡β-防御素7(登录号:NM_001001194)为模板,设计特异性引物,扩增鸡β-防御素7基因,目的基因与pET32a载体相连,构建表达质粒并导入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和抗菌试验。结果表明,PCR扩增的目的片段,经测序证明与鸡β-防御素7基因NM_001001194序列同源性达99%,经IPTG诱导表达的重组蛋白与预期大小相符。平板抑菌试验结果表明,该重组多肽对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌活性。     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达

对鸡β-防御索-3(Gal-3)在毕赤酵母中的分泌表达进行了研究.以重组质粒CaJ-3-T为模板,利用PCR技术扩增出Gal-3基因成熟肽片段,将该片段插入到酵母表达载体pPICZα-C,构建分泌型重组表达载体pPICZα-C-Gal-3,电转入表达宿主菌X-33毕赤酵母,Zeocin抗性筛选重组菌株;挑取阳性菌株经甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4.5 kDa位置出现预期条带;对所表达的Gal-3进行抗菌活性检测,发现其具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细黹的活性.     

鸡β 防御素Gal 3在大肠杆菌中的诱导表达

利用 IPTG 作为诱导剂进行鸡β 防御素 3 基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。分别对影响重组蛋白表达的因素（IPTG浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和溶氧量）进行优化,最终得到最佳的IPTG诱导条件： IPTG的终浓度为0.6 mmol/L,诱导起始吸光度A₆₀₀为0.6,最适溶氧量为150 mL 三角瓶装50 mL培养基,且在 33 ℃ 下诱导4 h 重组蛋白表达量达到最大。该方法为工程化生产提供良好的试验依据。     

猪β防御素-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建标记基因可去除的β防御素-1(pBD-1)基因乳腺特异性表达载体,利用RT-PCR方法从猪脾脏中克隆获得pBD-1基因,再插入乳腺特异性表达骨架载体pBC1-neo中;经PCR、酶切电泳以及测序鉴定,确认成功构建出乳腺特异性表达pBD-1的载体。进一步将上述功能片段亚克隆至能将标记基因全部去除的骨架载体MCS-3s-loxP-GFP中,成功构建了一种筛选标记可全部去除的乳腺特异性3s-loxP-GFP-pBC1-pBD1转基因载体。该载体为研究pBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机制,以及创制乳腺高效表达pBD-1的转基因猪育种新材料和通过哺乳以提高新生仔猪抗病力奠定了基础。     

高表达牛气管防御素的真核重组载体的构建及其鉴定

根据GeneBank中牛TAP的序列设计了1对特异性引物,采用RT-PCR方法从牛气管组织扩增牛TAP基因,并克隆到pEASY-T3载体。测序结果表明,扩增的片段含有144 bp核苷酸,编码48个氨基酸,与已报道的bTAP有1个氨基酸不同。该基因与真核表达载体FG9重组,经过PCR,酶切和测序鉴定,筛选牛TAP基因重组真核表达载体。使用脂质体法将FG9-TAP重组质粒转染293T细胞,斑点ELISA检测结果表明,成功构建了高表达牛TAP基因的真核表达载体,为抗金黄色葡萄球菌转牛TAP基因奶牛培育研究奠定基础。     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.     

鸡β-防御素3(Gal-3)基因的克隆、表达及抑菌活性研究

【目的】克隆和表达鸡β-防御素3(Gal-3)基因,并对其抑菌活性进行研究,为寻找替代抗生素的抗菌肽提供试验依据。【方法】利用RT-PCR方法,从鸡心脏中分离并克隆了鸡Gal-3基因,将其与分子伴侣基因SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET-20b连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;最后,对Gal-3融合蛋白进行纯化,并对表达产物进行体外抑菌试验。【结果】通过RT-PCR扩增获得了约240bp的鸡Gal-3基因,经IPTG诱导获得约26ku的蛋白。IPTG在终浓度为0.6mmol/L,33℃诱导4h,诱导时菌体A600为0.6,蛋白表达量最高,且多数以可溶形式存在,33℃上清中的蛋白含量比37℃上清高。纯化的蛋白对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。【结论】成功克隆并表达了鸡Gal-3基因,其原核表达产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌活性。     

鼠防御素基因Crp4在大肠杆菌中的表达及活性检测

通过基因工程技术,以鼠防御素基因Crp4为研究对象,从鼠回肠末端克隆了鼠防御素Crp4基因的成熟编码序列(约为102 bp),将其与另外2个鼠防御素基因的氨基酸序列进行比对,发现同源性分别高达97.8%和97.1%。将该序列克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组质粒pET-Crp4,转化DE3感受态并用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Wersiernblot结果表明,该基因在pET-28a中成功表达。体外抑菌试验证实,重组Crp4蛋白对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、大肠杆菌等具有一定的抑菌活性。     

苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

AFL1基因是苹果控制花发育的关键基因之一。在已得到AFL1 cDNA基因的基础上,将AFL1克隆到原核表达载体pET28b中,获得了重组表达质粒pET-AFL1,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳分析,结果显示,AFL1基因在大肠杆菌中成功表达,表达的AFL1融合蛋白分子量大约为53 kD。     

鸡β-防御素-9的融合表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的探究重组禽β-防御素6 (AvBD6)、禽β-防御素9 (AvBD9)蛋白的原核表达及其生物学特性。方法将AvBD6和AvBD9成熟肽基因克隆到表达载体pGEX-6P-1上,进而将重组表达质粒转化到BL21(DE3)pLysS 感受态中,用IPTG进行诱导表达后对其进行纯化,SDS-PAGE电泳分析重组蛋白AvBD6和AvBD9的表达情况,继而检测其体外抗菌活性并用透射电镜观察细菌形态变化,检测重组蛋白对鸡红细胞的溶血活性。结果重组AvBD6和AvBD9蛋白诱导表达的分子量约为30 ku,且主要在上清中表达。2种重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抗菌活性。电镜观察显示：菌体内容物外泄,损伤严重,并且重组蛋白对鸡红细胞无溶血活性。结论本研究制备的AvBD6和 AvBD9重组蛋白具有良好的生物安全性和抑菌效果,为进一步研究其抗菌机制及临床初步应用奠定了基础。     

人肥胖基因大肠杆菌表达载体的构建及其诱导表达

通过设计1对PCR引物（上游引物,5-′GCCATATGGTGCCGATCCAAAAAG-3′,下游引物,5-′GAGAATTCCCTTCAAGGCCTCAG-3′）,采用PCR方法扩增出人肥胖基因编码成熟肽的核苷酸序列,将扩增产物从琼脂糖凝胶上回收后插入测序载体pMD-18-T后进行了核苷酸序列测定。将经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的扩增产物插入经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的大肠杆菌表达载体pET-28a（＋）,构建了可在大肠杆菌中高效表达人瘦蛋白的表达载体。将表达载体转化入大肠杆菌菌株BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测,结果表明构建的人肥胖基因表达载体得到高效表达,重组蛋白占到菌体总蛋白的31.2%。     

大肠杆菌原核表达载体pSBET-His的构建

为了构建原核表达载体pSBET-His。pSBETa质粒经XbaI和BamH I限制性内切酶双酶切,获得原核表达载体的骨架。以pET28a(+)为模板,通过高保真PCR法应用T7 promoter引物和T7 terminator引物对pET28a(+)载体T7表达区域进行扩增,PCR产物电泳纯化后经双酶切和纯化获得138 bp含His-Tag序列的片段。将pSBET原核表达载体骨架和含有His-Tag序列的片段进行连接后转入DH5α感受态细胞中,经菌落PCR及酶切筛选构建pSBET-His。成功构建了pSBET-His原核表达载体。应用该载体表达的蛋白质,可采用镍离子亲和层析法进行纯化。该研究为应用pSBET-His载体进行烟草丛顶病毒ORF4的原核表达研究奠定了基础。     

人β防御素3基因工程菌株的IPTG诱导条件优化

对人β防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的摇瓶生长和诱导条件进行了优化.对装液量、接种量和初始pH对菌种生长的影响进行了比较.结果表明,装液量对菌株生长影响最大.IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对目的蛋白表达的试验结果显示,温度是一重要影响因素.进一步研究表明,菌株在37℃生长,在28~34℃以0.2 mmol.L-1IPTG诱导4 h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量最高可以达到总蛋白的29.8%.     

猪表皮生长因子在大肠杆菌中的表达

采用RT-PCR方法从猪肾脏皮质组织中扩增出pEGF基因，将其连接到克隆载体pMD18-T上，经测序鉴定正确后，再克隆到原核表达载体pET-41a（＋）上，构建重组表达质粒pET-EGF．用重组质粒转化Ecoli BL21（DE3）宿主菌，经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳和Western-blotting对GST—EGF融合蛋白进行分析，结果表明37℃诱导表达的融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的20．2％；30℃诱导表达的可溶性融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的7．7％．     

人防御素 hβD-3基因在大肠埃希菌中的融合表达

研究了人类防御素hβD-3基因在大肠埃希菌细胞中的融合表达,采用pET-32a(+)载体在BL21(DE3)溶原菌中进行了F-βD-3蛋白的融合表达.结果表明,F-βD-3蛋白的表达量达到127.23μg/mL,融合蛋白经镍柱亲和层析与肠激酶酶切后,最终得到hβD-3蛋白的量为18.17μg/mL.经对大肠埃希菌K12D31的抑菌试验鉴定,肠激酶酶切后产物为有抑菌活性的重组hβD-3蛋白.     

鸡β-防御素Gal-3在转基因紫花苜蓿中的表达

【目的】在紫花苜蓿中表达鸡β-防御素3(Gal-3),为利用紫花苜蓿规模化生产Gal-3奠定基础。【方法】PCR扩增鸡Gal-3基因,以潮霉素作为转基因植物的选择标记,将鸡β-防御素Gal-3基因克隆至表达载体pCAM-BIA1390R(简写为p1390R)上,构建重组表达质粒p1390R-Gal-3;采用冻融法将质粒p1390R-Gal-3转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化至紫花苜蓿;采用PCR检测、Southern blot筛选阳性转基因苜蓿植株,并对Gal-3蛋白进行抑菌活性研究。【结果】PCR扩增获得了240bp的鸡Gal-3基因,成功构建植物表达载体p1390R-Gal-3,在苜蓿中初步建立了Gal-3的遗传转化体系,共获得22株转基因苜蓿植株,其中4株为阳性植株,转化率为18.2%。PCR扩增和Southern blot检测表明,Gal-3基因已整合到转基因苜蓿基因组中。提取转基因苜蓿的Gal-3蛋白进行抑菌活性试验,结果显示转基因苜蓿对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有抑制作用。【结论】获得了具有抑菌活性的转鸡β-防御素Gal-3基因的苜蓿植株。     

萨能奶山羊β-防御素-3基因的克隆、序列分析及差异表达

β-防御素-3(BD-3)基因在乳腺炎病程中有重要作用,目前尚未见有关山羊BD-3基因的研究报道,根据已发表的牛的BD-3基因序列的编码区(CDS)设计引物,经RT-PCR、连接T载体、挑取克隆和测序,成功克隆出长度为210bp的萨能奶山羊BD-3基因CDS区,并提交至GenBank。分析该CDS区的核苷酸和氨基酸序列,结果表明,所得核苷酸序列与牛、人的序列同源性分别为91.2%和80.9%;其氨基酸序列在萨能奶山羊BD-3蛋白的功能结构域(含23~67个氨基酸)与人的结构域同源性为99.9%,蛋白质三级结构相似。分别用热灭活的金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、大肠杆菌对乳腺上皮细胞刺激0、2、4、6、8h,观察BD-3基因的mRNA水平变化,结果显示,金黄色葡萄球菌刺激4h后,BD-3表达量达到最高,与对照组相比差异极显著(P0.01);停乳链球菌刺激后,BD-3表达量持续升高,8h时与对照组差异极显著(P0.01);大肠杆菌刺激后,BD-3表达量逐渐升高,4h时达到最高,但与对照组差异不显著,之后表达量逐渐下降。成功克隆出山羊BD-3基因,并且在金黄色葡萄球菌、停乳链球菌的刺激下有较高水平的表达,说明BD-3基因在乳腺炎病程中起到重要作用,为乳腺炎的机理研究提供借鉴。