番鸭细小病毒与鸭圆环病毒二重PCR方法的建立

根据基因库中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法。用该方法对同一样品中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的模板进行PCR扩增,结果均得到了与实验设计相符的351bp（鸭圆环病毒）和474bp（番鸭细小病毒）的扩增条带,而对鸭Ⅰ型肝炎病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性测定结果表明：该二重PCR技术最低能检出100fg的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA模板。研究建立的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭圆环病毒和番鸭细小病毒感染的检测。     

安徽番鸭细小病毒的分离和PCR检测

为研究安徽省番鸭细小病毒遗传变异状况,通过番鸭胚接种分离了安徽流行株,并进行PCR检测。将扩增基因序列AH-MDPV-1和AH-MDPV-2在NCBI数据库中进行相似性搜索比对,结果显示,两者与番鸭细小病毒基因同源性均大于99%;与鹅细小病毒基因同源性分别介于79%~90%和78%~81%之间。进一步将AH-MDPV-1与7条参比的细小病毒基因序列进行比对,可见番鸭细小病毒的该部分基因相对较为保守,而与鹅细小病毒基因相应区域具有明显差异,表明该基因特异性较强,可以作为番鸭细小病毒的鉴定依据。同时可判定该病毒分离株为番鸭细小病毒。     

樱桃谷肉鸭短喙长舌综合征病原的分离鉴定

2015年3月以来,我国山东、江苏和安徽等地肉鸭群出现了一种疾病,该病以鸭喙发育不良,舌头外伸为特征。根据症状,暂将该病命名为鸭短喙长舌综合征(duck beak atrophy and dwarfish syndrome,BADS)。从不同地区5个发病肉鸭群采集130余份样品,取5份样品进行病原的分离。细菌培养结果均为阴性(4株大肠杆菌从肝脏常规分离);获得5份鸭胚培养物。该培养物不能凝集鸡红细胞。对5株分离株株进行PCR检测,结果显示鸭瘟病毒、坦布苏病毒、鸭甲肝病毒、鸭星状病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒、鹅多瘤病毒、鹅腺病毒、禽网状内皮组织增生征病毒等均为阴性,鹅细小病毒呈阳性。采用基于鹅细小病毒VP3基因的PCR方法对74份样品(肝脏和泄殖腔棉拭子)进行检测,阳性率为100%。该分离株661bp的VP3核苷酸序列与鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行分析,结果显示该分离株与鹅细小病毒82-0321v株和SHM319株亲缘关系最近,核苷酸同源性分别为98.8%和98.3%;与番鸭细小病毒同源性较低,在77.6%~78.8%之间。用鸭胚分离的SDLC01株感染1日龄雏鸭能引起鸭上、下喙萎缩、舌头外伸等症状。上述结果表明,从BADS患鸭体内分离得到鸭细小病毒(duck parvovirus,DPV),其可能与BADS具有相关性。     

鹅细小病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

为建立一种敏感、自动化,高通量的检测病料中鹅细小病毒（GPV）的PCR-DHPLC检测方法,本研究首先根据GenBank上GPV标准毒株VP3基因序列设计一对引物,建立检测GPV的PCR方法,然后将PCR检测方法与DHPLC法进行有机结合,建立了GPV PCR-DHPLC检测方法。以GPV、鹅副粘病毒、鸭瘟病毒及正常番鸭胚尿囊液进行特异性试验,结果无交叉反应,表明该检测方法具有较高的特异性。对GPV阳性样品检测结果表明该方法的敏感性较高,是常规PCR电泳法的100倍,且具有较好的重复性。对临床上采集的100份疑似病料,分别应用PCR电泳法和本试验建立的PCR-DHPLC方法进行检测,结果阳性符合率为100%。表明该方法具有特异、敏感、快速、重复性好、可高通量检测等优点,可用于临床样品的大批量检测。     

黑龙江省绥芬河市野猪血清常见疾病抗体监测

[目的]了解绥芬河地区野生野猪曾感染过的常见传染病。[方法]对采集的24份血清样品进行猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病、传染性胃肠炎、圆环病毒病、细小病毒病等6种疾病的抗体检测。[结果]发现24份野生野猪血清中:猪瘟抗体阳性样品1份,猪细小病毒抗体阳性样品22份,猪蓝耳病、伪狂犬病、传染性胃肠炎、圆环病毒2型抗体阳性样品均为0份。[结论]绥芬河地区野生野猪曾感染过猪瘟和细小病毒病。     

番鸭细小病毒套式PCR检测方法的建立及应用

通过比对分析GenBank上登录的多株番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）和鹅细小病毒（Goose parvovirus）全基因序列,选取两种病毒间相似性较低的区域设计合成了2对特异性引物,建立了能快速鉴别诊断MDPV的套式PCR方法。该法仅能特异地扩增MDPV,敏感性达到62copies／uL,比普通PCR高1000倍。运用该方法对分离的12份临床样品进行检测,结果检测出2份MDPV。本试验所建立的套式PCR方法可用于MDPV感染的临床诊断和流行病学调查。     

番鸭细小病毒感染的诊断

针对番鸭细小病毒VP3基因片段,通过PCR检测番鸭细小病毒核酸,利用RT-PCR和PCR方法排除鸭病毒性肝炎和鸭瘟感染,利用非免疫雏鹅接种试验排除小鹅瘟病毒感染,确诊引进的番鸭患鸭细小病毒病.     

新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)抗体的方法,本研究以纯化的重组σC蛋白作为包被抗原,并对该方法的反应条件进行优化,建立了NDRV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对NDRV血清检测为阳性,与番鸭呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭源鹅细小病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。其批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。利用建立的σC蛋白间接ELISA方法对80份疑似鸭血清样品进行检测,结果显示与NDRV全病毒间接ELISA的符合率为88.75%。本研究建立的ELISA方法为NDRV的流行病学调查提供了快速、特异的血清学检测方法。     

猪细小病毒ELISA检测报告

利用猪细小病毒IgG抗体检测ELISA试剂盒对某猪场妊娠母猪的38份血清进行检测。结果表明,该样本中34份血清为阳性,3份假阳性,1份阴性,阳性率达到89.5%。     

鸭细小病毒套式PCR检测方法的建立与应用

鸭细小病毒是新近发生的引起樱桃谷肉鸭短喙、长舌、发育迟缓的1种新型水禽细小病毒,目前尚无可靠的快速诊断方法。本研究根据鸭细小病毒的VP3基因设计了2对特异性引物,建立了套式PCR检测方法。该方法对鸭细小病毒DNA的最低检出量为100copies,不能扩增鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭肠炎病毒等。采用该方法对采自山东、江苏、安徽等地的30份疑似鸭细小病毒感染病料进行检测,结果显示阳性率为27/30(90%),与病毒分离结果符合率为90%;而普通PCR的阳性检出率为8/30(26.7%)。上述结果表明,建立的套式PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于鸭细小病毒的临床诊断和分子流行病学调查。     

新型鹅细小病毒研究进展

鸭细小病毒病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)或番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)引起的一种传染病。经典MDPV和GPV毒株引起的病鸭主要症状为腹泻、脚软、渗出性肠炎,三周龄内雏鸭感染发病率和死亡率都很高。但是2008年下半年以来,福建省、浙江省、安徽省及江苏省等地的雏半番鸭和樱桃谷鸭陆续出现一种新型细小病毒病,该病发病率10%~30%,病死率低于3%,临床症状主要为软脚、短嘴和生长障碍。通过对该病病原进行全基因组测序及系统发育树分析,结果发现该病原与鹅细小病毒亲缘性很近。本文通过比较新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,N-GPV)与经典的MDPV和GPV在基因组、感染宿主范围和致病性的区别,为新型鹅细小病毒病的防控提供理论依据。     

Evidence of Muscovy duck parvovirus in Muscovy ducklings in California

Muscovy duck parvovirus (MDPV) has been demonstrated in tissue samples from one- to four-week-old commercially reared Muscovy ducks that were weak, unable to walk and had a high mortality rate. On postmortem examination, the thigh and leg muscles, and the myocardium were found to be pale, and there was a fibrinous exudate on the capsule of the liver, and ascites. The parvovirus was isolated in embryonated Muscovy duck eggs and visualised by negative stain electron microscopy, detected by polymerase chain reaction (PCR) directly from the tissues, and antibodies to it were detected by immunoelectron microscopy, ELISA and immunofluorescence. In addition, the PCR products obtained that represented 1625 bp (74 per cent) of the capsid vP1 gene, including a hypervariable region between Derzsy's disease virus or goose parvovirus and MDPV, were sequenced and shown to be 100 per cent homologous with the MDPV 89384 reference strain, but only 82.3 per cent homologous with Derzsy's disease virus.     

鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)L基因和番鸭细小病毒(MDPV)Vp3基因的保守序列,采用Primer Premier 5.0软件设计并合成了2对引物。通过优化反应条件及特异性、敏感性评价,建立了能同时检测鸭源NDV和MDPV的二重PCR方法。该方法对鸭源NDV和MDPV的检测敏感性分别为30和16 fg。同时使用该方法对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌进行检测,结果显示全为阴性。本研究建立的鸭源NDV和MDPV的二重PCR检测方法,具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭源NDV和MDPV感染的快速鉴别检测。     

鹅细小病毒和番鸭细小病毒双重PCR检测方法的建立

根据GenBank上登录的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)基因序列,分别设计合成针对GPV非结构蛋白(NS)和MDPV NS2-VP1基因片段的2对引物GPV U/L和MDPV U/L,将GPV和MDPV提取核酸混合后作为模板,优化PCR反应条件,建立了能同时检测这2种病毒的双重PCR。特异性试验结果显示,引物GPV U/L仅特异性扩增出GPV-GZ1和GPV-GZ2株730bp核酸片段,引物MDPVU/L仅特异性扩增出MDPV的624bp核酸片段,双重PCR扩增出长度分别为730bp和624bp的2条特异性片段,而扩增鸭瘟病毒(DPV)和鹅副黏病毒(GPMV)的核酸扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,双重PCR能同时检测到14.4pg的GPV核酸和28.8pg的MDPV核酸。结果表明,建立的双重PCR可用于GPV和MDPV的鉴别诊断和联合检测。     

Direct electron microscopic virus detection in diseases of goslings and Moscovy ducks (Cairina moschata)]

Various organs of goslings and Muscovy duck chickens were investigated by electron microscopy, with the negative contrast technique being used in a routine diagnosis programme. Investigations were extended over several years and were, more specifically, applied to 1,148 samples obtained from 525 goslings and 429 samples which had been collected from 139 Muscovy duck chickens. Viruses were directly detected in 132 or 76 samples. Parvoviruses were predominant in geese and Muscovy ducks and accounted for 83.3 or 94.7%. Rotaviruses, reoviruses, and adenoviruses were sporadically diagnosed. Most of all positive findings were recorded from intestinal matter, liver, and heart. Parvovirus-related diseases were practically removed from among goslings, owing to efficient immunoprophylaxis on all larger goose units. Small privately owned flocks were found to play a role as pathogen reservoirs for both goslings and Muscovy ducks.     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸭副黏病毒(DPMV)和鸭圆环病毒(DuCV)保守基因序列,设计了2对针对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好,对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性分别达到160和140个拷贝数;该方法特异性强,对鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原体的检测全为阴性;应用该方法对118份临床病料进行检测,结果检出鸭副黏病毒和鸭圆环病毒阳性感染率分别为0.85%和8.47%,无混合感染。本试验建立的二重荧光定量PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,适用于鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的快速诊断和监测。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR-RFLP方法的建立

根据GenBank登录的鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）非结构蛋白（NS）基因特征,本研究设计1对特异性引物对GPV和MDPV基因组DNA进行PCR扩增,目的片段大小均为810 bp,并对PCR产物进行切胶回收。用EcoRⅠ酶对GPV和MDPV特异性胶回收产物进行酶切鉴定,结果显示MDPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段,大小为530和280 bp;而GPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。本研究建立了一种快速区别GPV和MDPV感染的检测方法,可对番鸭感染水禽细小病毒的情况进行快速鉴别诊断。