仔猪断奶前腹泻抗病基因育种技术的创建及应用

产肠毒素大肠杆菌（ETEC）F4ac是引起仔猪断奶前腹泻最主要的细菌性病原,仔猪小肠上皮细胞有无ETECF4ac受体是仔猪被感染时是否发病的关键。任军等（2012）利用大规模资源家系群体和远缘群体,通过全基因组连锁定位分析、目的区域的重组断点事件分析和远缘群体高通量SNP标记的关联性分析等严谨的遗传学分析手段,确定了ETECF4ac受体基因为MUC13,     

抗仔猪断奶前腹泻猪专门化新品系的培育

利用江西农业大学获国家发明专利和国家技术发明二等奖的“仔猪断奶前腹泻(ETECF4ac)抗病基因育种技术”结合常规育种技术,历时6 年培育了BN101系、BN102 系和BN103 系3 个抗仔猪断奶前腹泻基因(MUC13 基因)抗性型(GG)纯合的瘦肉型抗仔猪断奶前大肠杆菌(ETEC)F4ac 腹泻猪专门化新品系。3 个新品系仔猪断奶前腹泻发生率均显著低于常规未经选育群体,且其生长、繁殖、产肉以及体型外貌等性状均表现优良,达100 kg 平均日龄分别为155.43 d、158.21 d 和159.27 d,100 kg 体重平均活体背膘厚分别为:8.96 mm、9.47 mm 和9.52 mm,经产母猪平均总产仔数分别为:10.43 头、12.31 头和12.79 头,料肉比分别为:2.38、2.44 和2.48,且变异系数都在10% 以下。这些专门化新品系的成功培育实现了我国抗病种猪培育的新突破。     

邦农Ⅰ号猪配套系的研究与应用

利用MUC13抗病基因育种新技术,培育出三个抗大肠杆菌（ETEC）F4ac仔猪断奶前腹泻猪专门化新品系.在此基础上,通过配合力杂交试验,筛选出最佳杂交组合方式,形成邦农Ⅰ号（BN Ⅰ号）猪配套系.BN Ⅰ号猪配套系商品肉猪不仅具有高效的抗仔猪断奶前ETEC F4ac腹泻特性,且表现出优异的生长和产肉性能,商品猪BN301达100 kg体重校正日龄为157.56 d,100 kg体重活体校正背膘厚为11.17 mm,30～100 kg日增重为892.59 g,料肉比为2.37,屠宰率为76.68％,胴体瘦肉率为65.83％,肌内脂肪含量2.39％,变异系数在10％以内,群体整齐度好,具备较高的综合经济效益和推广价值,在前期已得到较大面积示范推广,应用前景广阔.     

长白种猪抗腹泻后代选育探究

为探索利用现代生物技术培育种猪抗腹泻专门化品系，采长白种猪耳组织样品27份，送江西农业大学动物生物技术国家重点实验室培育基地进行抗腹泻基因检测，检测结果为：腹泻抗性有利基因GG型个体比例占40.74%（11/27），G的基因频率为0.67，A的基因频率为0.33。将作过基因检测的种猪按照不同基因型进行选配，分别为对照组（GG×GG）、试验1组（GG×GA）、试验2组（GA×GA），观察、统计、比较不同组合所产仔猪在断奶前的腹泻发生率、腹泻死亡率、断奶成活率等指标。试验结果表明：1）对照组（GG×GG）哺乳仔猪腹泻发生率3.08%（2/65），哺乳仔猪腹泻死亡率0（0/65），30日龄断奶仔猪成活率98.46%（64/65），这3个指标均与试验1组、试验2组差异显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）；2）试验1组（GG×GA）后代腹泻发生率20.75%（11/53）与试验2组（GA×GA）后代腹泻发生率40.91%（18/44）差异显著（P＜0.05），这可能与试验1组的选配公猪是抗腹泻基因型（GG）个体有关；试验1组与试验2组腹泻死亡率差异极显著（P＜0.01），断奶成活率差异不显著（P＞0.05）；3）携带腹泻抗性有利基因GG型比例高的后代，哺乳仔猪腹泻率和腹泻死亡率低，断奶仔猪成活率高，表现出较强的抗腹泻力，在种猪世代选育中，加大GG纯合抗性个体的选留比例，最终可以建立长白种猪抗K88（F4）腹泻专门化品系。     

猪SLA-DRA基因外显子2多态性及其与仔猪腹泻的关联分析

为探索SLA-DRA基因作为猪抗病育种分子标记的可能性,本研究采用PCR-SSCP和克隆测序方法对大白、长白和杜洛克共216头猪的SLA-DRA基因外显子2进行了多态性研究,分析了该基因与仔猪腹泻的关联性。结果,在SLA-DRA外显子2上检出了3个等位基因和6种基因型;6种基因型(AA、AB、BB、AC、BC和CC)在大白猪和长白猪中都存在,而在杜洛克猪中只检出4种基因型(AA、BB、AB和BC)。杜洛克猪与大白猪和长白猪间基因型分布均差异极显著(P<0.01);3个品种的基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。最小二乘法分析表明,品种和性别对仔猪腹泻影响不显著(P>0.05),基因型与仔猪腹泻显著相关(P<0.05);AA和BB基因型个体腹泻评分的最小二乘均值均显著高于AC和CC基因型个体(P<0.05)。本研究表明,SLA-DRA基因不同基因型对仔猪腹泻有着重要的影响,可作为猪抗病育种应用中的一个潜在遗传标记。     

猪m6A去甲基化酶FTO、ALKBH5基因表达水平与大肠杆菌F18感染抗性的关系分析

为了探讨猪6-甲基腺嘌呤（m⁶A）去甲基化酶mRNA表达水平与仔猪大肠杆菌F18抗性的关系,本研究运用实时荧光定量PCR方法检测m⁶A去甲基化酶FTO和ALKBH5基因在35日龄苏太猪断奶仔猪大肠杆菌F18抗性型和敏感型个体十二指肠和空肠组织中的mRNA表达差异,同时分别利用F18ab、F18ac大肠杆菌菌体刺激和内毒素LPS诱导猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,检测FTO、ALKBH5基因表达变化。结果表明,FTO、ALKBH5基因在抗性型个体十二指肠和空肠中的表达量均极显著或显著高于敏感型个体（P<0.01,P<0.05）;不同F18大肠杆菌菌体刺激IPEC-J2细胞后,FTO基因表达水平均无显著变化（P>0.05）,而ALKBH5基因在F18ac刺激后表达量显著上调（P<0.05）;LPS诱导4 h时,FTO和ALKBH5基因表达量均显著上调（P<0.05）。本研究在细胞和个体水平上初步验证并发现了m⁶A去甲基化酶FTO和ALKBH5基因表达水平与大肠杆菌感染仔猪密切相关,为今后深入研究RNA去甲基化修饰在仔猪细菌性腹泻调控中的作用机制提供了理论基础。     

仔猪ETEC F4受体研究进展

猪病给养猪生产造成的经济损失约占总产值的12％～15％（施启顺,2001）。仔猪腹泻在动物生产中是一种非常普遍的疾病,仔猪在断奶前和断奶后腹泻发病率均占6％～7％（Svensmark等,1989）。断奶前腹泻致死头数占出生仔猪头数的2．7％和同期死亡头数的11．9％（Nielsen等,1974）,达25kg体重平均日龄比正常个体晚2d,导致生产效率下降3％（Svensmark等,1989）。而且,断奶前发生胃肠道疾病的仔猪,在断奶后更容易发生腹泻和其它疾病感染。     

贞芪颗粒对仔猪断奶应激的影响

本研究利用断奶仔猪模型探究复方中兽药贞芪颗粒对断奶仔猪生长、腹泻及断奶应激的影响。通过测定仔猪生长性能、腹泻率、空肠绒毛形态、生长及应激相关激素水平,发现21日龄断奶相比于28日龄断奶对仔猪的增重、腹泻率、肠道损伤的影响更大,表明21日龄断奶可对仔猪造成更严重的断奶应激。利用21日龄断奶仔猪模型,比较了贞芪颗粒给药组和不给药组仔猪的断奶应激相关指标,发现贞芪颗粒可显著降低仔猪腹泻率并缩短腹泻持续时间,27日龄时给药组仔猪皮质醇激素水平显著降低（P<0.05）,43日龄时给药组仔猪血清中生长激素（GH）含量极显著升高（P<0.01）。以上结果表明,贞芪颗粒具有一定的缓解仔猪断奶腹泻、提高仔猪抗应激及促生长效果。     

八眉猪DQB基因多态性及其与仔猪腹泻的相关性研究

为了探讨SLA-DQB基因作为猪抗病育种辅助选择标记的可能性,试验采用PCR-RFLP方法对八眉猪SLA-DQB基因外显子2的多态性及其与仔猪腹泻的相关性进行研究。结果表明:八眉猪SLA-DQB基因外显子2多态性并不丰富,仅检测出3个等位基因和5种基因型,其多态信息含量为0.23,遗传杂合度仅为0.24;八眉猪DQB基因外显子2变异程度比较低。该群体偏离了HardyWeinberg平衡(P0.01)。仔猪腹泻与性别不相关(P0.05),与DQB基因外显子2的基因型之间呈现极显著相关(P0.01),AA和AB基因型腹泻评分均极显著高于AC、BB和CC基因型(P0.01)。不同性别DQB外显子2的基因型对仔猪腹泻的影响不同。在公猪中,AB基因型个体的腹泻评分高于AA、AC、BB、CC个体(P0.05);而在母猪中,AA和AB腹泻评分极显著高于AC、BB和CC(P0.01),可见性别影响了DQB外显子2基因型与腹泻之间的关系。说明八眉猪DQB基因外显子2多态性较低,其基因型对仔猪腹泻有影响,可作为猪抗病育种的选择标记。     

苏淮猪群体抗腹泻基因MUC13和FUT1多态性分析及其抗腹泻选育方案研究

腹泻是现代猪场集约化规模养殖过程中常见的疾病,给养殖场带来巨大的经济损失。产肠毒素大肠杆菌F4ac以及F18是导致仔猪腹泻的重要病原微生物,而MUC13和FUT1分别是控制仔猪大肠杆菌F4ac以及F18易感或抗性的主效基因。本试验对淮安市淮阴种猪场的苏淮猪核心群做了MUC13和FUT1基因的多态性检测。结果表明:在整个苏淮猪核心群中MUC13的G等位基因频率较高,其中公、母猪群体分别达到0.625和0.568,有利于苏淮猪抗腹泻性能的选育提高;然而FUT1的A等位基因频率较低,其中公、母猪群体分别为0.250和0.190。根据苏淮猪MUC13和FUT1基因多态性结果,制定了以MUC13基因的选择为主,FUT1基因选择为辅的抗腹泻群体的分子选育方案,以期通过结合常规育种手段来提高苏淮仔猪对腹泻的抗性。     

MUC13基因第2内含子插入/缺失突变对基因表达和经济性状的影响

研究报道MUC13基因第2内含子的插入/缺失突变与ETEC F4导致的仔猪腹泻病密切相关,但该突变位点是否会对基因表达和经济性状(如一般抗病力、生产性状及繁殖性能等)造成影响还有待评估。本试验通过PCR方法检测大白猪群体中该突变位点的多态性,并分析其对大白猪MUC13基因mRNA表达水平、部分重要细胞因子水平(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TGF-β及TNF-α)、生产性状及繁殖性能的影响,以探究将该位点作为抗性遗传标记应用于抗病育种实践的可行性。结果表明:该位点在大白猪群体中存在3种基因型;不同基因型个体间组织mRNA表达水平、重要细胞因子水平、生产性状及1~4胎繁殖性能(总产仔数、产活仔数和断奶仔猪数)差异均不显著(P0.05)。综上所述,将MUC13基因第2内含子插入/缺失突变作为大白猪抗性遗传标记进行分子选育时,不会对机体基因表达和重要经济性状造成显著影响。本研究为将该突变位点作为大白猪抗仔猪腹泻分子选育遗传标记的可靠性提供了一定的理论依据。     

苏太仔猪FUT1基因M307位点多态性与F18大肠杆菌抗病相关性的体外鉴定

采用PCR-RFLP方法检测了江苏苏太断奶仔猪FUT1基因M307位点等位基因多态性分布,在所检的49头仔猪中,GG基因型个体16头,AG基因型19头,AA基因型14头。在此基础上,制备上述不同基因型个体仔猪小肠上皮细胞,分别与表达F18ab菌毛的野生型大肠杆菌、表达F18ac菌毛含fed操纵子全基因的重组大肠杆菌和V型系统表面分泌表达F18abFedF亚单位的重组大肠杆菌进行体外黏附试验和黏附抑制试验。研究结果表明:FUT1基因M307位点中GG型和AG型仔猪小肠上皮细胞均能黏附上述3种大肠杆菌,而AA型个体小肠上皮细胞则不能黏附。将上述3种大肠杆菌分别与抗F18ab菌毛高免血清、F18ac菌毛高免血清及抗F18abFedF亚单位单因子血清作用后,则失去黏附仔猪肠上皮细胞能力。上述结果对苏太猪从体外试验上证明了FUT1基因M307位点多态性与断奶仔猪腹泻和水肿病存在着直接的相关性。     

4个主效基因与英系长白猪繁殖性能的相关性分析

为寻找有效的分子标记用于英系长白猪辅助育种进而提高其繁殖性能,在英系长白猪群（169头）中采用PCR-RFLP技术,进行雌激素受体（estrogen receptor,ESR）、视黄醛结合蛋白（retinol binding protein 4,RBP4）、瘦素（leptin,LEP）和促卵泡素亚基β（follicle-stimulating hormone β,FSHβ） 4种与繁殖性状相关基因的基因型频率检测,利用SPSS 19.0统计软件,采用最小二乘法将各基因不同基因型与总产仔数、产活仔数、断奶窝重、断奶头数进行了相关分析。结果显示,ESR、RBP4、LEP基因均以A为优势等位基因,FSHβ基因以B为优势等位基因,其中LEP、FSHβ基因多态位点符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05）,而ESR、RBP4基因多态位点处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.01）;LEP基因在长白猪母猪中表现为BB基因型为有利基因型,其总产仔数、产活仔数、断奶头数分别比AB基因型高1.3219、1.6855、1.1710头（P<0.05）;FSHβ基因中AA基因型为不利基因型,BB基因型断奶窝重比AA基因型高5.1129 kg（P<0.05）;ESR、RBP4基因对长白母猪繁殖性能均无显著影响（P>0.05）,而LEP、FSHβ基因可能作为有价值的候选基因应用于英系长白猪的分子标记辅助选择。     

环江香猪黏附素13基因多态性及其与仔猪腹泻的相关性分析

试验旨在对环江香猪仔猪腹泻抗性/易感的黏附素13基因（MUC13）单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）/单倍型与仔猪腹泻的相关性进行分析。试验采用高分辨率熔解曲线（high resolution melting,HRM）技术对93头环江香猪腹泻仔猪和95头健康对照仔猪进行基因分型,结合DNA测序对HRM检测结果进行验证,并通过SHEsis在线平台确定其单倍型。结果显示,环江香猪MUC13基因的G224A位等位基因分布频率在腹泻组和对照组间差异显著（P < 0.05）,GG、GA和GG+GA基因型分别与AA基因型相比差异均显著（P < 0.05）。A112G、T170C和G164C位点各基因型频率和等位基因频率在腹泻组和对照组之间差异均不显著（P > 0.05）,腹泻组与对照组E位点均为野生纯合基因型。单倍型Ⅹ（GTAC）在腹泻组的分布极显著高于对照组（P < 0.01）。因此,MUC13基因G224A位点和单倍型Ⅹ（GTAC）与环江香猪仔猪断奶前腹泻相关。     

引进美国SPF杜洛克种猪抗腹泻基因检澳及后代选育研究

为在种猪世代选育中加大GG纯合抗性个体的选留比例,建立杜洛克抗性K88（F4）腹泻专门化品系,试验对引进美国SPF杜洛克种猪后代中的43头（其中母猪37头、公猪5头）进行耳朵组织采样,样本送往江西农业大学动物生物技术国家重点实验室培育基地进行抗腹泻基因检测;之后将已检测过抗腹泻基因的种猪分为2组,试验组按GG（♀）×GG（♂）、对照组按GG（♂）×GA（♀）进行配种,并进行后代选育研究。结果发现：杜洛克种猪群GG基因型个体比例高达86．05％,仅有5头GA基因型个体和1头AA基因型个体;在相同的饲养条件下,试验组哺乳仔猪腹泻发生率为2．97％、死亡率为0．99％,30日龄断奶仔猪成活率为97．03％,与对照组差异明显。     

猪m6A甲基化酶WTAP基因与F18大肠杆菌感染的关系

本研究旨在探讨猪m⁶A甲基化酶WTAP表达水平与大肠杆菌（E. coli）感染抗性的关系。选取35日龄苏太断奶仔猪（Sus scrofa）大肠杆菌抗性型和敏感型个体各4头,采集十二指肠和空肠组织,利用RT-qPCR检测WTAP在E. coli抗性型和敏感型个体十二指肠、空肠的表达差异,并分别利用产肠毒素大肠杆菌（F18ab、F18ac）刺激和内毒素（LPS）诱导猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,检测WTAP基因的表达变化。同时构建WTAP基因干扰载体并转染IPEC-J2细胞,通过菌毛定量、菌落计数以及间接免疫荧光试验检测该基因沉默对大肠杆菌黏附能力的影响。结果显示：在十二指肠和空肠组织中,WTAP基因在E. coli抗性型个体中的表达量显著高于敏感型个体（P<0.01）;并且在F18ab和F18ac刺激后表达量显著下降,与LPS诱导6 h后结果相一致（P<0.01）。沉默WTAP基因后,大肠杆菌黏附能力极显著上升（P<0.01）。本研究在细胞和个体水平上验证发现,m⁶A甲基转移酶WTAP的高表达可能有助于仔猪抗大肠杆菌感染,为进一步揭示仔猪抗大肠杆菌感染的RNA甲基化调控机制奠定基础。     

IL6基因内含子3多态性与仔猪腹泻、生长和公猪繁殖性状的关联分析

旨在研究猪IL6基因的多态性及其与猪经济性状相关的关联性,寻找与仔猪腹泻、生长和公猪繁殖性状相关的分子标记。利用PCR扩增在IL6基因的内含子3,检测到1个SNP位点g.1704674CT,该SNP可引起HpaⅡ酶切位点的改变。通过PCR-RFLP检测281头民猪仔猪、182头长白仔猪、215头杜洛克公猪以及69头大白公猪IL6基因的多态性,分析多态位点与仔猪腹泻、生长和公猪繁殖性状的关联性;利用Real-time PCR技术分析IL6基因在LPS刺激民猪外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)后的表达模式。结果表明,在民猪仔猪中,CC型个体的腹泻指数显著高于TT型个体(P0.05),CC型个体的14、21、28、35日龄体重及日增重均显著低于TC型个体(P0.05),且CC型个体的21日龄体重也显著低于TT型个体(P0.05);在长白仔猪中,TT型个体的出生重显著高于CC型个体(P0.05),7日龄体重显著高于TC型个体(P0.05);在杜洛克公猪中,TT和TC基因型个体射精量显著大于CC基因型个体(P0.05);在大白公猪中,CC基因型个体精子密度显著大于TC基因型个体(P0.05)。PBMC受LPS刺激12和24h后,IL6基因表达量均显著升高(P0.01或P0.05)。综上表明,IL6基因g.1704674CT位点对仔猪腹泻、生长以及公猪繁殖都有一定的影响,可作为猪育种过程中一个潜在的分子标记。     

泌乳料采食量和仔猪早期补料对母猪及仔猪性能的影响

哺乳母猪料采食和哺乳仔猪料采食对仔猪个体和窝性能的影响见表4、5。哺乳母猪料采食水平对窝断奶数（P〈0．93）和断奶前死亡率（P〈0.76）无影响。自由采食组母猪提高了仔猪窝总增重（P〈0.04）和日增重（P〈0.04）并有比限饲组母猪增加断奶重（P〈0.10）的倾向。相似的情况还有窝总增重（P〈0．04）、日增重（P〈0.03）和断奶时仔猪个体重（P〈0.06）,在自由采食组母猪也有提高。     

大蒜素对断奶仔猪生长性能的影响

本研究以断奶仔猪为试验对象,研究在断奶仔猪基础饲料中添加不同水平的大蒜素,对其生长性能及腹泻率的影响,并确定大蒜素的最适添加量。试验选择120头21日龄断奶的仔猪按照单因子试验设计,将其随机分为4个处理组,每组30头断奶仔猪。每组断奶仔猪分别饲喂含有0 mg/kg （对照组）、100 mg/kg （试验1组）、200 mg/kg （试验2组）、400 mg/kg （试验3组）的大蒜素基础饲料。预试验期1周,正式试验期4周,试验结束后记录断奶仔猪的平均日增重、料重比、腹泻率等指标。结果显示,试验2组和试验3组断奶仔猪的试验末重显著高于对照组（P<0.05）;平均日增重显著高于对照组（P<0.05）;料重比显著低于对照组（P<0.05）;腹泻率比对照组极显著降低了2.79、3.56个百分点（P<0.01）。综上所述,断奶仔猪养殖生产中添加200 mg/kg的大蒜素可以有效改善其生长性能,并且极显著降低腹泻率。     

E．Coli腹泻影响混养仔猪的增重和福利

西班牙的研究人员研究了在存在大肠杆菌（Escherichiacoli）腹泻的情况下，对断奶前混养仔猪断奶前和断奶后阶段的生长、行为和生理应激指标的影响。用相邻猪舍（A和B，每栋12窝）24头母猪及其窝仔猪进行研究，每窝选6头（3公3母）仔猪作为重点研究对象。在B栋猪舍，