应用MTT比色法评价不同牛血清促细胞生长作用

细胞培养过程中血清的选择对细胞的促生长增殖具有重要作用。本试验分别以商品新生牛血清、自制新生牛血清、自制成年牛血清培养成纤维细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞,通过MTT比色法来判断细胞的增殖能力,进而对血清质量作出评价。结果表明,自制新生牛血清具有良好的促细胞生长作用(相对生长率＞0.96),并且3次试验结果比较差异不显著(P＞0.05),具有较好的重复性;而成年牛血清和无血清空白对照组促细胞作用不明显。因此应用MTT比色法能够评价血清质量。     

牛血清中蛋白组分初步分析及其对细胞培养的影响

为探讨牛血清中蛋白组分对细胞培养的影响,应用凝胶过滤层析对不同牛血清进行初步组分分析,并应用MTT比色法衡量不同牛血清的促细胞生长作用.结果表明,蛋白组分大小相对较为一致的新生牛血清、商品血清1、2、5(一个波峰)与蛋白组分差异较大的成年牛血清、商品血清3、4(两个或者两个以上波峰)的促细胞生长作用相比较差异显著(P相似文献   

新生牛血清促细胞生长活性检测方法的建立与应用

牛血清是医药生物技术产品中重要的原辅材料之一,做好牛血清的质量控制是提高生物制品质量的重要环节。本研究通过应用PK15、BHK21和ST三种兽用生物制品研制中常用的细胞作为载体,选用国内同等价位5个不同厂家生产的新生牛血清作为比较对象,采用细胞倍增时间测定法、细胞克隆形成率测定法、细胞三次连续传代培养法、MTT比色法和微量终点稀释法五种血清质量鉴定的方法进行比较,检测新生牛血清的促细胞生长活性,最终确定了MTT比色法作为便捷高效快速筛选新生牛血清的检测方法。     

反复冻融新生牛血清对促细胞生长效应的影响

选择促细胞生长性能良好的三批新生牛血清，经不同次数冻融后用其配制MEM培养淹，用于培养SP2／0细胞，从细胞最大增殖量和倍增时间2个指标测定促细胞生长效应。结果，用经不同次数冻融的新生牛血清配制的MEM培养液，对SP2／0细胞的最大增殖量和倍增时间影响不大；但反复冻融20次以上的新生牛血清配制的培养没使细胞的倍增时间延长。由此可见，为了防止细胞倍增时间延长，所用新生牛血清的冻融次数应该控制在20次以内。     

不同品种牛血清对3T3L1前脂肪细胞增殖与分化的影响

研究不同品种牛血清对3T3-L1细胞增殖与分化的影响,采用模型细胞体外培养法模拟牛脂肪组织生长环境,为牛大理石纹肉早期选择提供一种可能性的方法。抽取17头秦川牛和28头秦杂牛血清,先制备没灭活和灭活血清组培养细胞,MTT法检测细胞增殖相对数,油红O检测脂肪含量,再用不同品种牛血清培养细胞,检测细胞增殖相对数和脂肪含量,以及用比色法测定三磷酸甘油脱氢酶(GPDH)和脂肪酸合成酶(FAS)活性。结果表明,灭活血清培养细胞的增殖相对数量在分化培养第2和4天与分化脂肪含量在第2、4、6和8天都极显著高于没灭活血清组 (P＜0.01);秦杂牛血清培养细胞的数量在第2和4天显著高于秦川牛 (P＜0.05),秦川牛血清培养细胞分化的脂肪含量在第8天显著高于秦杂牛 (P＜0.05),其他天数没有显著性差异 (P＞0.05);分化第8天的细胞内GPDH和FAS酶活两牛种间没有显著性差异 (P＞0.05)。结果显示自制血清灭活比没灭活的更利于细胞的培养;牛血清品种是影响前脂肪细胞增殖与分化的因素,秦杂牛血清可能更有利于前脂肪细胞的增殖,而秦川牛血清可能更有利于前脂肪细胞的分化,但仍需进一步研究。     

羔羊血清促细胞生长效果的研究

为研究羔羊血清促细胞生长的效果,用羔羊血清以及羔羊与新生牛混合血清来培养VERO、BHK-21细胞,同时培养SP2/0-Ag14细胞并进行计数。结果表明：羔羊血清促细胞生长效应明显低于新生牛血清,但是与牛血清以不同比例混合后,促细胞生长效应有明显的提高,比例在4∶6和5∶5时,促细胞生长能力与牛血清接近。因此,在细胞培养过程中,把羔羊血清和新生牛血清按1∶1混合使用,既可降低成本,又具有良好的促细胞生长效果,使羔羊血清得到了充分利用,并产生一定的经济效益和社会效益。     

几种动物血清作为CEF培养天然培养基的比较研究

测试了６种不同动物血清作为鸡胚成纤维细胞（ＣｈｉｃｋｅｎＥｍｂｒｙｏＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＣＥＦ）培养天然培养基的效果。其结果为：所试各血清对ＣＥＦ均具有促细胞贴壁作用。胎牛血清、鸡血清、兔血清促细胞生长作用较强，２４ｈ可使ＣＥＦ长满单层；胎牛血清支持细胞生存期最长（２０ｄ），其次是成牛血清和山羊血清（１７ｄ）。     

奶牛MTT比色法的最佳条件探讨

为建立奶牛淋巴细胞增殖反应MTT比色法,对试验条件进行了研究。应用L16(45)正交试验,对影响MTT比色法的四个主要因素,包括ConA浓度、细胞浓度、培养液小牛血清浓度及培养时间进行了比较和探索。试验表明几个因素对其增殖反应都有显著影响(P<0.05),且最佳反应条件为:15μg/mL的ConA、1×106/mL细胞浓度、10%小牛血清及60h的培养时间;影响增殖反应的先后顺序为细胞浓度、ConA浓度、培养时间及血清浓度。     

不同批次新生牛血清对MDCK细胞培养效果的研究

为筛选适宜MDCK细胞生长的最佳血清，分析6个批次新生牛血清在两种培养方式即贴壁静置培养条件下MDCK细胞的生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养条件下MDCK细胞的生长状态、生长速率、生长动力学情况。结果表明6组新生牛血清贴壁静置培养的MDCK细胞，平均集落形成率最大的为第Ⅴ组，最小的为第Ⅰ组，由大到小依次为第Ⅴ、Ⅵ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ组；微载体悬浮培养条件下的MDCK细胞，最大增殖密度从大到小依次为第Ⅳ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅱ、Ⅰ组，平均倍增时间由大到小依次为第Ⅵ、Ⅴ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ组。因此，通过对不同批次血清贴壁静置培养的MDCK细胞生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养的MDCK细胞生长状态、生长动力学评价，筛选出适宜细胞生长的新生牛血清批次为第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组，而第Ⅰ组新生牛血清对细胞生长的促进效果不明显，细胞生长状态不佳。     

兽用生物制品生产用牛血清质量标准研究——牛血清对Sp2/0细胞增殖试验研究

为制定兽用生物制品生产用牛血清对Sp2/0细胞增殖试验的质量标准,将处于对数生长期的Sp2/0细胞分散,配制成50万/mL细胞悬液,用含10%不同牛血清的MEM营养液,在96孔细胞培养板上作对倍稀释,在5%CO2培养箱37℃培养48 h,计数每种血清对Sp2/0细胞的绝对克隆形成率。结果表明,胎牛血清对Sp2/0细胞的绝对克隆形成率为20%-26%,犊牛血清对Sp2/0细胞的绝对克隆形成率为12%-18%。以胎牛血清作为标准参考血清计算不同牛血清对Sp2/0细胞的相对克隆形成率,3批胎牛血清的相对克隆形成率均在80%以上,6批有效期之内的新生牛血清的相对克隆形成率为50%左右。因此,将兽用生物制品生产用胎牛血清对Sp2/0细胞增殖试验的质量标准规定为对标准血清相对克隆形成率不低于80%;新生犊牛血清对Sp2/0细胞增殖试验的质量标准规定为对标准血清相对克隆形成率不低于50%。     

不同胎牛血清对动物细胞体外培养的影响

本研究针对血清在细胞库构建中的基础性作用,以中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的20枚京星矮脚鸡的7日龄蛋胚为试验材料,利用2 种不同的胎牛血清,采用贴壁培养方法,对细胞进行培养、传代及冻存。观察细胞原代及传代后的生长个体数、生长瓶数,细胞形态、冻存前形态及细胞生长曲线。结果表明,不同血清对细胞培养有一定的影响,血清B培养的细胞各方面都优于血清A培养的细胞。本研究结果为细胞体外培养中的血清选择提供了依据。     

Methionine deficiency and its hydroxy analogue influence chicken intestinal 3-dimensional organoid development

Methionine and its hydroxy analogue(MHA)have been shown to benefit mouse intestinal regeneration.The intestinal organoid is a good model that directly reflects the impact of certain nutrients or chemicals on intestinal development.Here,we aimed to establish a chicken intestinal organoid culture method first and then use the model to explore the influence of methionine deficiency and MHA on intestinal organoid development.The results showed that 125-mm cell strainer exhibited the highest efficiency for chicken embryo crypt harvesting.We found that transforming growth factor-b inhibitor(A8301)supplementation promoted enterocyte differentiation at the expense of the proliferation of intestinal stem cells(ISC).The mitogen-activated protein kinase p38 inhibitor(SB202190)promoted intestinal organoid formation and enterocyte differentiation but suppressed the differentiation of enteroendocrine cells,goblet cells and Paneth cells.However,the suppression of enteroendocrine cell and Paneth cell differentiation by SB202190 was alleviated at the presence of A8301.The glycogen synthase kinase 3 inhibitor(CHIR99021),valproic acid(VPA)alone and their combination promoted chicken intestinal organoid formation and enterocyte differentiation at the expense of the expression of Paneth cells and goblet cells.Chicken serum significantly improved organoid formation,especially in the presence of A8301,SB202190,CHIR99021,and VPA,but inhibited the differentiation of Paneth cells and enteroendocrine cells.Chicken serum at a concentration of 0.25%meets the requirement of chicken intestinal organoid development,and the beneficial effect of chicken serum on chicken intestinal organoid culture could not be replaced by fetal bovine serum and insulin-like growth factor-1.Moreover,commercial mouse organoid culture medium supplemented with A8301,SB202190,CHIR99021,VPA,and chicken serum promotes chicken organoid budding.Based on the chicken intestinal organoid model,we found that methionine deficiency mimicked by cycloleucine suppressed organoid formation and organoid size,and this effect was reinforced with increased cycloleucine concentrations.Methionine hydroxy analogue promoted regeneration of ISC but decreased cell differentiation compared with the results obtained with L-methionine.In conclusion,our results provide a potentially excellent guideline for chicken intestinal organoid culture and insights into methionine function in crypt development.     

Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for bovine antibody (IgG) to Pasteurella haemolytica

The sensitivity of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for bovine IgG serum antibody to Pasteurella haemolytica was compared with that of an indirect hemagglutination (IHA) test. Pasteurella haemolytica serotypes were grown in a chemically defined cell culture medium, and soluble antigens released into the growth medium were used in the ELISA and IHA test. An ELISA with serotype-1 antigen consistently detected antibody in sera that were positive by IHA test (correlation, 99%). Sera reacting with serotype-1 ELISA antigens also reacted with ELISA antigens prepared from other serotypes. Although ELISA titers averaged 5 log2 units higher than IHA titers, plots of titers determined by the 2 methods were approximately linear. Titer increases detected in paired serum samples by either test were similar. The ELISA was more sensitive than was the IHA in detecting colostral IgG antibody in serum of newborn calves. The ELISA uses a simple, stable antigen preparation and detects antibody to P haemolytica serotypes that commonly infect cattle.     

一株MDBK细胞的低血清悬浮驯化研究

研究选取一株背景清晰、纯净的MDBK贴壁细胞,通过直接驯化和逐级降低血清相结合的办法,获得了一株可以在低血清培养基中全悬浮培养的MDBK细胞。该细胞在含0.5%胎牛血清的培养基中悬浮培养48 h后的细胞密度稳定在5.0×10⁶/mL以上,培养72 h后细胞密度最高可达1.16×10⁷/mL,且细胞形态良好,活力在93%以上,具有良好的传代稳定性。应用筛选获得的悬浮培养MDBK细胞株分别接种伪狂犬病毒和传染性牛鼻气管炎病毒后,检测病毒敏感性。细胞在24 h均发生了皱缩,72 h大部分死亡。悬浮培养的MDBK细胞对传染性牛鼻气管炎病毒的滴度在24 h达到最大值107.6TCID50/mL,对伪狂犬病毒的滴度在48 h达到最大值107.6 TCID50/mL,说明虽然细胞的培养方式发生了改变,但并没有影响上述两种病毒在该细胞上的增殖特性。对MDBK细胞的全悬浮驯化研究可为相关病毒类疫苗规模化生产及工艺的升级改进提供细胞学基础资料。     

不同培养体系对胎牛成纤维细胞体外培养的影响

研究不同培养体系对胎牛成纤维细胞体外培养的影响及用牛血清白蛋白代替血清培养胎牛成纤维细胞的可行性。利用M199、DMEM、α-MEM、DMEM/F124种培养体系通过组织块贴壁培养对成纤维细胞体外培养液进行筛选,以α-MEM组细胞生长状况较好。分别用含2、4、6、8、10mg/mL BSA的α-MEM培养液对胎牛成纤维细胞进行原代及传代培养,5种浓度的BSA对原代培养时细胞开始游离出组织块的时间影响不明显,均在培养后的48h有成纤维细胞和上皮细胞混合游离出,但在传代培养时,胎牛成纤维细胞在8mg/mL BSA浓度的α-MEM中贴壁率较高。结果表明:培养胎牛成纤维细胞时,可用BSA代替血清,较适宜的培养体系为含8mg/mL BSA的α-MEM培养液。     

Cell lines from sheep and cattle blood

A simple and reproducible method of establishing cell lines from the blood of sheep and cattle is described. Buffy coat cells were allowed to adhere to plastic culture flasks in media containing 20 per cent autologous plasma overnight. The fluids were then replaced with growth medium supplemented with non-inactivated foetal calf serum, lamb serum or autologous serum. Ovine cell lines were established with any of the serum supplements but bovine cell lines were established more readily if unheated autologous serum was used.