发根农杆菌介导抗菌肽Shiva1基因转化马铃薯的初步研究

利用已构建载体530Shiva,转化马铃薯普通栽培种甘农薯1号、澳布、HLS和夏波蒂的试管苗及块茎盘的研究。结果表明,以Kan50mg·L-1和100mg·L-1作为筛选转基因细胞和植株的剂量。对于发根农杆菌侵染马铃薯试管苗应采用新鲜菌落直接涂抹伤口进行侵染,这种方法诱导生根率高且易于操作,根诱导率、成愈率及分化率远高于浸泡法;发根农杆菌转化试管苗,后期愈伤组织分化产生5个幼苗。发根农杆菌菌液侵染甘农薯1号和夏波蒂两品种的块茎盘,7d后就有很小的毛状根突起产生,2周后即有大量毛状根产生,3周后毛状根产生量有所减少,产生的毛状根3周时其成愈率分别为31.0%和27.0%,愈伤组织分化成苗比较困难,分化出3个幼苗,分化率分别为6.45%和3.70%。转化材料进行冠瘿碱检测表明,分化苗均为胭脂碱阳性反应。环腐病菌接种试管苗结果表明,分化植株与对照相比抗性明显增强。     

用根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌转化马铃薯的初步研究

根癌土杆菌菌株T_(37),C_(58)和B_6S_3单独或与C_(58) CIpGV 3850::110(?)neo(带有一嵌合基因NOS—NPT使植物产生卡那霉素抗性)接种马铃薯块茎盘。每块茎盘肿瘤数因细菌菌株、马铃薯基因型和所取块茎盘在块茎上的位置而变化。T_(37)诱导的品种Desiree的肿瘤分化了芽。大部分肿瘤的分化芽合成胭脂碱,表明是经pTiT—DNA转化的。用发根土壤杆菌菌株A_4诱导的毛状根切段培养后再生成株。再生植株具有明显的表型变异,并有agropinc合成,证明是经pRiT—DNA转化的。     

马铃薯品种‘并薯6号’遗传转化体系的建立

以马铃薯品种‘并薯6号’无菌试管苗茎段作为外植体,通过对遗传转化过程中预培养时间、植物激素的种类及配比、筛选剂浓度和抗生素的种类及浓度进行研究,初步建立了马铃薯品种‘并薯6号’的愈伤再生转化体系。结果表明,预培养时间为2 d时,愈伤组织诱导率、出苗率及转化频率最高。最适外植体愈伤组织诱导的培养基配方为MS+2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.5 mg/L 2,4-二氯苯酚代乙酚(2,4-D)+0.4 mg/L激动素(KT),愈伤组织的诱导率为86.7%,愈伤组织形态较紧密,为深绿色,茎段两端膨大呈哑铃状,表面的白色须状物和毛状根较少。最适愈伤组织分化的培养基配方为MS+1 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+1 mg/L赤霉素(GA_3)+1 mg/L玉米素(ZT),幼苗比较粗壮,长势良好。最适的植株再生及生根筛选剂为10 mg/L的潮霉素(Hygromycin B,Hyg),转化频率较高,为20.3%。农杆菌抑制剂的最适浓度为200 mg/L的特美汀(Timentin,TMT),且在愈伤组织诱导、分化及生根阶段都需要加入TMT。综上所述,通过对农杆菌介导的愈伤再生转化过程中各个因素的研究,初步建立了‘并薯6号’的遗传转化体系,为马铃薯分子育种发展提供一定的基础。     

PVYCP基因导入加工型马铃薯甘农薯1号的研究

利用整合有马铃薯Y病毒外壳蛋白基 (PVYCP基因 )的改建质粒PEY3,以土壤农杆菌为载体转化加工型马铃薯新品种甘农薯 1号叶盘 ,细菌侵染 14d后用 10 0ml/LKM在愈伤组织水平上选择 ,转化率最高可达 2 1 3%。转化效率与细菌生理状态、NAA浓度、叶盘预培养天数有关。转化体分化 2株再生植株。冠瘿碱分析证明转化体整合了PVYCP基因。     

马铃薯耐盐碱愈伤组织筛选及分化研究

以马铃薯12个主栽品种的茎、叶为外植体进行愈伤组织诱导和耐盐碱愈伤组织的筛选,MS分化培养上分化及植株再生的研究。结果表明:愈伤组织诱导率高的品种有夏波蒂、大西洋,诱导率分别为96.1%、92.9%,而且愈伤组织质量最好;筛选出耐盐碱性强的愈伤组织品种有坝薯10号、冀张薯5号及1867;对于芽的分化,分化率高的品种有坝薯8号、坝薯10号;筛选出了抗盐碱性强的再生苗7株,抗性中等的60株,抗性弱的3株,共70株。     

根癌农杆菌介导的马铃薯高效遗传转化体系的研究

通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立了马铃薯栽培品种“费乌瑞它(Favorita)”茎段和试管薯的遗传转化体系,其转化频率分别可达25.6%和36.8%。实验结果表明,玉米素有助于茎段和试管薯转化再生芽的分化,乙酰丁香酮可以提高茎段的转化率,但对试管薯的转化作用效果不明显。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果显示,在分化培养基上再生的转化植株假阳性率较高,在遗传转化工作中要加大转基因植株的数量,才有可能获得所期望的转基因植株群体。     

根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究

为了进一步完善根癌农杆菌介导的小麦遗传转化体系,以小麦成熟胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化小麦的主要影响因素,结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织获得率和分化率为转化指标,小麦成熟胚在预培养基CM4C1P上预培养14d后,用侵染培养液Ⅰ侵染3 h,再经干燥共培养方式处理3 d,是根癌农杆菌介导成熟胚转化的合适条件.在优化条件下,转化约30 d后GUS稳定表达的愈伤组织数占受体组织总数的15.83%;GUS稳定表达的抗选择剂G418的植株数占受体组织总数的0.28%.     

温度、pH对马铃薯多酚氧化酶活性的影响

对加工型马铃薯试管苗、茎段愈伤组织、块茎及块茎芽在不同温度、不同 pH条件下PPO活性的检测结果表明 :pH对马铃薯PPO活性具有明显的影响 ,块茎芽以及愈伤组织PPO活性均在 pH 5～ 5 5之间最高 ,分别为 94 2 0及 2 0 4 0 (0 0 1ΔOD/min) ,而试管苗在培养基 pH为 8时PPO活性最高 (19 80 (0 0 1ΔOD/min) )。不同温度下不同品种PPO活性表现不同 ,甘农薯 1号、Atlantic试管苗PPO活性在 18～ 2 5℃之间达到高峰 ,分别为 16 80和 37 2 0 (0 0 1ΔOD/min) ;Shep ody、Snowden试管苗在 5℃下PPO活性较高 ;除此之外 ,不同品种贮藏块茎PPO活性均在 2 5℃表现最高。     

农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素

为了研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素,以6个小麦品种成熟胚为外植体进行离体培养,以EHA105和LBA4404农杆菌为供体(含有pCAMBIA1305双元载体)材料,研究了诱导培养基、分化培养基、农杆菌菌株、愈伤组织诱导培养时间、农杆菌菌液浓度和侵染时间对小麦成熟胚愈伤组织诱导、分化、再生的影响。结果表明:(1)以小麦品种小偃22的成熟胚为材料,获得最佳的诱导培养基方案(MS+2mg.L-1 2,4-D+0.5mg.L-1 KT+500mg.L-1水解酪蛋白+150mg.L-1天门冬酰胺)和分化培养基方案(MS+2mg.L-1 ZT+0.5mg.L-1 KT);(2)6个小麦品种中,洛阳8176和张掖春小麦具有较强的再生能力,筛选培养后较多的愈伤组织分化出小绿点;(3)洛阳8716和张掖春小麦的成熟胚,经愈伤组织诱导培养6-7d,农杆菌侵染后愈伤组织再生能力强;(4)农杆菌侵染后愈伤组织的再生能力与农杆菌菌株的关系不明显,而与小麦品种基因型、侵染时间和菌液浓度有较明显的关系;(5)以小麦洛阳8716和张掖春小麦成熟胚愈伤组织为受体,黑暗条件下诱导培养6-7d,在24±1℃黑暗条件下共培养3d和500mg.L-1羧苄青霉素(Cb)除菌及10mg.L-1潮霉素筛选处理后,共得到分化植株23株,其中以洛阳8716为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为11株和4株,植株分化率分别为3.57%和1.31%;以张掖春小麦为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为5株和3株,植株分化率分别为1.57%和1.14%。     

苦参毛状根的诱导培养及氧化苦参碱含量的测定

本文主要利用三种发根农杆菌A4、15834、R1601诱导苦参产生毛状根,初步为建立苦参的毛状根培养体系提供参考。本实验采用共培养法,考察了不同外植体、菌种、培养时间对苦参毛状根诱导率的影响,并对苦参毛状根中氧化苦参碱进行初步的含量测定。研究结果表明,苦参毛状根的最佳诱导条件是以生长1周的苦参幼芽为外植体,R1601为菌株,添加100μmol/l的乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃暗处诱导,最终测定诱导率最高为27.6%,存活率为45.8%,而苦参毛状根中氧化苦参碱的富集量为1.68mg/g(苦参毛状根干重),未检测到苦参碱。