毕赤酵母工程菌表达人白细胞介素-2突变体发酵条件的优化

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌(KM71/pPIC9K-MvhIL-2,本室构建)能分泌表达三突变体人白细胞介素-2(MvhIL-2),突变位点分别为125 Cys→Ala; 18leu→Met; 19leu→Ser.通过对其发酵条件的研究,探索重组人白细胞介素-2突变体工程菌KM71/pPIC9K-IL-2的生长及产物表达规律,通过3因素(即:发酵液起始pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间)从3个不同水平上进行正交试验,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,得出摇瓶发酵表达MvhIL-2的最佳条件:发酵液初始pH 6.0,甲醇诱导浓度为0.5%,诱导72 h,最终使目的产物达到菌体总蛋白的30%以上,表达的MvhIL-2考马斯亮蓝染色条带最明显,为其进一步上发酵罐,大量生产重组人白细胞介素-2奠定了基础.     

人白细胞介素-2突变体在大肠杆菌中的克隆表达与鉴定

根据GenBank报道的人白细胞介素-2(hIL-2)基因分析设计并合成引物,以本室构建的pPIC9K/IL-2突变体(编码125位半胱氨酸→丙氨酸、18位亮氨酸→蛋氨酸、19位亮氨酸→丝氨酸)为模板,PCR扩增出突变型人白细胞介素-2基因.用EcoR I和BamHI对目的基因进行双酶切后,插入大肠杆菌表达载体pBV220,转化宿主菌JM109,经菌落PCR筛选阳性重组子、酶切坚定,DNA序列分析证实,重组质粒pBV220/IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放阅读框.经42℃热诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为15 kD的外源蛋白产生,经Western印迹证明为rhIL-2.成功建立了突变型人白细胞介素-2(rhIL-2)基因的大肠杆菌表达系统,为rhIL-2的生产及临床应用奠定基础.     

米黑根毛霉脂肪酶的克隆表达及发酵条件优化

米黑根毛霉脂肪酶RML是一种重要的工业用酶,具有非常广泛的应用前景。本研究将人工合成的RML基因rml克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建pPIC9K-rml诱导型表达载体。表达载体经线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,并使用抗生素G418筛选、三丁酸甘油酯-MM板及PCR方法筛选阳性重组工程菌。工程菌发酵液经SDS-PAGE分析、三丁酸甘油酯板鉴定,表明脂肪酶RML在毕赤酵母中获得高效表达,且蛋白分子大小与预期一致。进一步优化了发酵条件,包括对培养基组分、诱导剂浓度和发酵温度等的优化。优化后的培养基组成为：甘油4.0%,（NH4）2SO45.000 g/L,CaSO40.465 g/L,K2SO49.100 g/L,MgSO4.7H2O7.450 g/L;培养条件为：pH值6.0,生长阶段温度30℃,诱导阶段采用22℃低温诱导,诱导期每24 h补加甲醇浓度为3%。优化后,发酵液中的RML活力最高达到116 U/ml,比优化前提高了3.14倍。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2（ChIL-2）基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K构建重组表达载体pPIC9K／ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母（Pichia methanolica）GS115甲醇利用型重组表达菌株．经SDS—PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16ku与14ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质．     

HER2/neu ECD毕赤酵母工程菌大规模发酵工艺研究

采用补料分批培养方法,在80 L发酵罐中对HER2/neu ECD工程菌进行高密度发酵,发酵温度28℃,pH值为4.4,溶氧范围25%以上。在湿重值达到180 g/L时开始诱导,甲醇诱导体积分数为0.5%,发酵时间96 h。发酵液离心后,上清经阳离子交换层析,对其表达产物进行纯化。结果表明:在优化发酵条件下,发酵上清通过阳离子交换层析纯化,可获得纯度较高的重组HER2/neu ECD,产量为600 mg/L。     

猪IL-18在毕赤酵母中分泌表达条件的优化

采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中亚克隆出IL-18基因并完成了真核融合表达载体pPIC9K-IL-18的构建和IL-18在毕赤酵母中的表达,在此基础上从发酵时间、不同诱导型、pH值、诱导剂量和接种量等方面对重组基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化,进一步探索了酵母菌表达猪IL-18的发酵工艺.结果表明,摇瓶发酵时,诱导最佳时间为72 h,甲醇最适浓度为20 g/L,最适pH范围为6.0~8.0,最适接种量1∶1.与单纯甲醇诱导相比,甘油/甲醇诱导后的表达量明显提高.     

重组毕赤酵母摇瓶发酵产木聚糖酶条件优化

[目的]在摇瓶发酵条件下,研究甲醇诱导毕赤酵母工程菌K3产木聚糖酶表达规律。[方法]以重组木聚糖酶酶活为评价指标,采用单因素试验和L9（34）正交试验考察摇瓶发酵条件下pH值、接种时间、诱导剂浓度、诱导时间对酶活的影响。[结果]各因素影响程度依次为：pH值〉接种时间〉诱导时间〉甲醇浓度,最优表达条件为：pH值5.3,接种时间19h,甲醇诱导浓度1.25%,诱导时间192h,在此条件下菌株产酶酶活可达589.16IU/ml。[结论]该研究为木聚糖酶的工业化生产和应用提供依据。     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达

以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列（No.X06219）存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。     

罗非鱼热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达与纯化

以尼罗罗非鱼血液mRNA反转录获得编码罗非鱼Hsp70完整cDNA,重组构建罗非鱼真核表达载体pPIC9K/rtHsp70;在毕赤酵母Pichia pastoris KM71中表达重组罗非鱼的热休克蛋白70（rtHsp70）,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western blot分析;采用亲和层析、HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化目的蛋白。结果表明：克隆至pMD载体上的基因与目的基因完整编码区序列完全一致;诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western blot分析,上清液中蛋白条带大小与目的蛋白相对分子质量大小一致;每升诱导上清液可以获得约2 mg纯化蛋白。本研究中获得的rtHsp70毕赤酵母工程菌及纯化的rtHsp70为后期rtHsp70-肽疫苗研究奠定了基础。     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础.不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系.无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化.文章综述了几种有效能评价体系的测定技术.     

山茱萸多糖提取工艺优化及马钱苷含量测定

采用L（934）正交设计试验,对山茱萸浸提液中山茱萸多糖的酶水解法提取工艺进行了优化研究,并对浸提液的中有效成分马钱苷含量进行了HPLC法分析。结果表明,山茱萸多糖浸提的最佳工艺为：液料比1∶5,浸提时间4 h,浸提温度80℃,果胶酶添加量0.55 g/L。用HPLC法测定出的山茱萸浸提液中马钱苷平均含量为0.512 ...     

生态旅游潜在客源市场特征的调查研究--以湖南永州金洞森林旅游开发为例

为探明客源市场生态旅游消费的潜在特征,采用问卷调查的形式,就长沙市居民对湖南金洞生态旅游开发的意向等问题进行抽样调查．结果显示,生态旅游符合人们“回归自然”的旅游新时尚,有着极大的开发空间,指出生态旅游的开发要注重环境保护和可持续发展．开发的产品要以休闲度假类的大众产品为主,开发生态旅游都市客源市场还要多种渠道并用,尤其是要注重媒体的宣传．     

探究板栗的科学贮藏方法

板栗属壳斗科栗属(Castanea mollisima Blume),其种子属于顽拗型种子,不耐贮藏。基于近年来板栗贮藏保鲜技术研究成果,从合理采收、贮前处理、贮藏方法等方面进行论述。     

切花菊耐热性鉴定方法研究

以8个切花菊品种为材料,通过对离体叶片进行50℃高温胁迫后,采用电导法、电阻抗图谱法测定电导率、电阻,并对大田栽培植株进行田间高温胁迫试验,比较品种间的耐热性。结果表明:电导法测得的50℃直接相对电导率、修正相对电导率和电阻抗图谱法测得的胞外电阻在品种间有明显差异,但与田间高温胁迫法测定的热害指数不完全一致。电导法和电阻抗图谱法都可以作为测定切花菊耐热性的方法,但需要结合田间耐热性观察。     

《河北农业大学学报》创刊年代考

清光绪二十八年(1902)河北农业大学前身—直隶农务学堂诞生,经几易其名,于1958年更名为河北农业大学至今。清光绪三十一年(1905)直隶高等农业学堂时期创办了《北直农话报》,清光绪三十四年(1908)更名为《直隶农务官报》,中华民国七年(1918)改出《农学月刊》,中华民国十七年(1928)易名为《河大农刊》,中华民国二十三年(1934)更名为《河北通俗农刊》,中华民国二十四年(1935)易名为《河北农林学刊》,1948年更名为《河北农学院研究专刊》,1959年更名为《河北农业大学学报》至今。《河北农业大学学报》前身诸刊都与现时的《河北农业大学学报》有着一脉相承的历史渊源,各刊之间联系紧密,连续性、继承性强。因此,《河北农业大学学报》的创刊时间应追溯至1905年创办的《北直农话报》。     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。     

啤特果多糖提取工艺的研究

［目的］寻找开发啤特果产业的新途径,提高其附加值。［方法］采用水提醇沉法提取啤特果中的多糖,通过单因素试验和正交试验,以多糖的提取率为评价指标,对影响啤特果多糖提取工艺的因素进行研究。［结果］确定了提取啤特果多糖的最佳工艺参数为温度95℃,料液比1∶2,乙醇浓度67%。在该工艺条件下,啤特果多糖的得率为1.05%。［结论］该研究为开发利用啤特果提供理论依据。     

GEF7基因过表达拟南芥植株幼苗表型分析

利用已构建的过表达拟南芥(Arabidopsis)GEF7基因植株,在光照培养箱中进行培养,并与野生型植株进行对比分析,对GEF7基因过表达植株的幼苗表型进行了观察分析。结果表明,GEF7基因过表达植株幼苗的根长比野生型对照明显增加;其子叶形态、数目和幼苗形态等方面均有异常表型,表明GEF7基因的功能与根的发育有关,并参与调控植物的发育过程。     

黑豆不同部分馏油的体外抗氧化性比较

[目的]通过体外抗氧化体系比较黑豆不同部分馏油抗氧化性活性。[方法]通过正交试验优化索氏提取黑豆馏油的最佳工艺,提取黑豆不同部分馏油;研究黑豆不同部分馏油对羟基自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)的清除能力。[结果]在样品浓度为1.0 mg/mL时,黑豆不同部分馏油对·OH的清除率分别为全豆馏油83.9%、豆黄(黑豆去皮部分)馏油64.8%、豆皮馏油17.3%,对DPPH·的清除率分别为全豆馏油41.3%、豆黄馏油33.2%、豆皮馏油77.9%。[结论]黑豆不同部分馏油均具有较好的抗氧化性,是良好的天然抗氧化剂。黑豆不同部分馏油对·OH的清除能力从大到小依次为全豆馏油、豆黄馏油、豆皮馏油,对DPPH·的清除能力从大到小依次为豆皮馏油、全豆馏油、豆黄馏油。