影响口蹄疫贴壁种毒质量因素的研究

本文主要探讨影响种毒制备的一些因素,包括细胞状态、接毒量的改变及毒液保存条件对种毒质量的影响,研究得出如下结论:第一,细胞状态影响收毒时间的变化,同时一定程度上也影响LD50毒价的变化;第二,接毒含量增高收获时间缩短,而低剂量、正常剂量接毒传代试验均能获得合格的种毒支系,适宜的改变接毒量有助于提高种毒质量;第三,不论是4℃保存和还是-20℃冷冻保存,随着保存时间的延长,毒价匀有不同程度的损失,而且4℃保存的毒液下降率明显低于-20℃保存方式。因此,上述因素在生产中要细化研究对提高种毒质量起到指导意义。     

兽药与疫苗

猪Ｏ型口蹄疫灭活疫苗本产品主要用于预防猪Ｏ型口蹄疫。对猪注射免疫后15天产生免疫力,免疫保护期为半年,免疫抵抗力为10～20ＭＩＤ个攻毒量。体重25公斤以下每头1毫升,25公斤以上每头2毫升。4℃保存,保存期限一年。在全国各省推广使用。牛Ｏ型口蹄疫灭活疫苗本产品适用于牛、     

口蹄疫A型灭活疫苗毒种和种子批的研究

为了保证制苗及攻毒用毒种的质量和稳定性，在对制苗和攻毒毒种的毒力、特异性、保存期、扩繁代次等进行研究的基础上，建立了口蹄疫A型灭活疫苗制苗和攻毒用毒种种子批。结果表明，原始毒种和基础毒种的扩繁代次均控制在5代以内，适宜的保存方法和保存期均为加含500mL／L甘油的PBS后在-30℃保存1年、-70℃保存2年；用于生产抗原的工作毒种，最高扩繁代次控制在15代以内，最佳保存方法和保存期为加保护剂后在-20℃保存半年、-70℃保存1年；用于效力检验的攻毒毒种采用原始毒种。通过制苗和攻毒用毒种种子批的建立，规范了口蹄疫疫苗生产和检验过程中的毒种管理。     

猪圆环病毒2型ZJ/C株增殖条件的优化

为了在PK15细胞上获得更高滴度的猪圆环病毒2型(PCV2)ZJ/C株,本实验优化了细胞接种密度、接毒方法、接毒量与收获时间和冻融次数等条件。结果表明接种密度在2.5×10~5个/m L,同步接毒加D-氨基葡萄糖处理,接毒量为2%,接毒后90h收获,-20℃冻融2次,PCV2-ZJ/C株增殖效果最好。该结果为猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)的生产提供了依据。     

猪瘟兔化弱毒细胞疫苗的深液倾斜旋转培养与增液培养试验

1、用增加培养液量(3—4倍)旋转法培养猪瘟弱毒细胞疫苗,第一收、第二收病毒收获液的毒价均可达到普通旋转培养法的滴度。二收的绝大多数批次毒价用兔检5万倍通过,符合制苗要求。 2、用深液(培养液量增加7—8倍)倾斜旋转法培养猪瘟弱毒细胞疫苗。第一收与第二收的毒液或培养7天一次全收的毒液,其大多数试验批次毒价均可达到制苗标准。 3、用深液(培养液量增加8倍)倾斜旋转通气法培养猪瘟弱毒细胞疫苗,接毒后培养7天一次全收毒液,大多数批次试验毒价用兔检5万倍通过。符合制苗要求。以上三种培养方法所得资料说明提高猪肾细胞产毒量是明显的,工艺是简便的,在生产上是可行的。对细胞提高繁殖病毒能力的问题进行了某些探索。     

鸭坦布苏病毒病灭活疫苗生产工艺的研究

本研究对鸭坦布苏病毒灭活疫苗HB株生产工艺进行了筛选,通过不同接毒量和不同收获时间等相关试验,优化了规模化生产工艺,即鸭胚成纤维细胞按体积分数0.5%接种DTMUV HB株毒种,接毒后84h收获病毒液,收获毒液病毒含量达10~(7.1)TCID_(50)/0.1ml。     

脾毒保存期对猪瘟病毒增殖的影响

为确定脾毒保存期对猪睾丸细胞(Swine Testis,ST)繁殖猪瘟病毒的影响,选用不同保存期的脾毒接种ST细胞,培养猪瘟病毒,从感染率、产毒时间、病毒液效价、合格收次4个方面进行对比。结果显示,随着脾毒保存期延长,病毒对细胞感染率明显降低,产毒时间延后,所产病毒液效价下降,合格收次减少。提示保存期对ST细胞产毒有很大影响,在生产中应严格控制脾毒种毒的保存期。     

反复冻融次数和不同保存温度对病毒滴度的影响

为探讨在有宿主细胞的情况下,反复冻融和不同保存温度对病毒滴度的影响,将收集的含ST细胞培养的猪细小病毒和含Vero细胞培养的伪狂犬病病毒经过不同次数的反复冻融,测定其病毒滴度。将收集的猪细小病毒液和伪狂犬病病毒液分别在4、22、-20、-80℃保存,间隔一段时间后测定半数组织细胞感染剂量(TCID_(50)),以了解病毒滴度。结果显示,含ST细胞的猪细小病毒和含Vero细胞的伪狂犬病病毒经过反复冻融3次之后,病毒滴度比未经冻融的病毒滴度分别提高了1.81lg和1.86lg。同一温度下,随着放置时间的增加,病毒滴度均呈下降的趋势。在一定时间内,不同保存温度下病毒滴度有明显区别,但在-20℃和-80℃条件下保存的病毒滴度下降比4℃和22℃条件下保存的慢。因此,在培养病毒的时候可以用反复冻融3次的方法来提高病毒的滴度。4℃和22℃只能作为病毒的短期储存温度,-20℃和-80℃对于病毒来说是合适的保存温度。     

猪乙型脑炎病毒在Vero细胞上的繁殖特性及其灭活疫苗的免疫原性研究

试验旨在对猪乙型脑炎病毒（JEV,SA14-14-2株）在传代细胞上的繁殖培养特性及其制备的灭活疫苗免疫原性进行研究,确定猪JEV在细胞培养瓶中培养的关键技术参数及其灭活疫苗的免疫原性。以Vero细胞培养病毒,通过接种时间、接毒量、吸附时间、吸附温度、维持液pH、维持培养温度及培养时间7个条件的优化,将繁殖的病毒液冻融一次,采用病毒蚀斑数测定方法测定病毒滴度。按照优化好的条件繁殖一批毒液,经β-丙内酯灭活,与双相佐剂混合,制备成猪乙型脑炎灭活疫苗。两次免疫（间隔14 d）接种乙型脑炎抗体阴性仔猪,首次免疫前（0 d）、免疫后第7、14、21、28、35、42天采集血清,检测血清中和抗体。二免后第28天进行乙型脑炎P3强毒的攻击,攻毒前（0 d）、攻毒后第1、2、3、5、7、9天采集血浆,攻毒后第14天剖杀免疫猪,采集脑组织,检测血浆和脑组织中JEV。结果显示,用细胞培养瓶进行培养,将Vero细胞培养至48 h进行病毒接种,接种量为1 000 PFU/mL,病毒吸附温度为37℃,吸附时间为90 min,吸附后用pH 7.6~8.8维持液继续培养,培养温度为35℃,培养96 h后收获毒液,冻融一次,可获得较高滴度的病毒。仔猪免疫制备的灭活疫苗后血清抗体水平迅速升高,血浆和脑组织中均未检测出JEV,免疫组试验猪能抵抗强毒攻击,可获得有效免疫保护。本试验结果为猪乙型脑炎疫苗的生产提供了参考依据。     

猪乙型脑炎病毒在Vero细胞上的繁殖特性及其灭活疫苗的免疫原性研究

试验旨在对猪乙型脑炎病毒(JEV,SA14-14-2株)在传代细胞上的繁殖培养特性及其制备的灭活疫苗免疫原性进行研究,确定猪JEV在细胞培养瓶中培养的关键技术参数及其灭活疫苗的免疫原性。以Vero细胞培养病毒,通过接种时间、接毒量、吸附时间、吸附温度、维持液pH、维持培养温度及培养时间7个条件的优化,将繁殖的病毒液冻融一次,采用病毒蚀斑数测定方法测定病毒滴度。按照优化好的条件繁殖一批毒液,经β-丙内酯灭活,与双相佐剂混合,制备成猪乙型脑炎灭活疫苗。两次免疫(间隔14d)接种乙型脑炎抗体阴性仔猪,首次免疫前(0d)、免疫后第7、14、21、28、35、42天采集血清,检测血清中和抗体。二免后第28天进行乙型脑炎P3强毒的攻击,攻毒前(0d)、攻毒后第1、2、3、5、7、9天采集血浆,攻毒后第14天剖杀免疫猪,采集脑组织,检测血浆和脑组织中JEV。结果显示,用细胞培养瓶进行培养,将Vero细胞培养至48h进行病毒接种,接种量为1 000PFU/mL,病毒吸附温度为37℃,吸附时间为90min,吸附后用pH 7.6～8.8维持液继续培养,培养温度为35℃,培养96h后收获毒液,冻融一次,可获得较高滴度的病毒。仔猪免疫制备的灭活疫苗后血清抗体水平迅速升高,血浆和脑组织中均未检测出JEV,免疫组试验猪能抵抗强毒攻击,可获得有效免疫保护。本试验结果为猪乙型脑炎疫苗的生产提供了参考依据。     

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗耐热保护技术的研究

疫苗保护剂及其冻干工艺是影响疫苗效果的重要因素，对疫苗保存、运输及免疫效果有很大影响。为提高疫苗质量，在常规保护剂(明胶、蔗糖)基础上添加卡波姆、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮等基质，组成新型保护剂，分别在病毒液保存和疫苗冻干过程添加，并评价其病毒保护效果。结果表明：在半成品病毒液储存时加入10%新型保护剂，可使半成品保存期由原来的2个月延长至12个月。采用新型保护剂制备的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗，溶解性显著优于常规保护剂活疫苗，保存期由原来-20℃保存18个月提高到2～8℃保存36个月，且病毒活性及攻毒保护效力均优于原工艺产品，实现了储运过程中疫苗的冷藏储运，提升了疫苗的应用效果。     

生物缓冲剂HEPES对促进口蹄疫抗原稳定性的研究

口蹄疫抗原在储存和疫苗制备过程中容易降解,影响疫苗效果。口蹄疫抗原的降解速度与维持液的pH值的稳定性有关,制备出pH稳定性强的维持液可提高口蹄疫疫苗质量。对生物缓冲剂HEPES进行研究,分别用含有和不含有HEPES的MEM维持液在BHK细胞上培养病毒,将病毒放在37℃温箱内,分别在0、24、48、72h取样,通过微量细胞中和试验检测病毒效价,并进行比较。结果表明,在37℃条件下,不含生物缓冲剂的病毒液TCID50下降幅度比含生物缓冲剂的病毒液大,72h时,前者毒价为零,后者TCID50为10-2.5。由此可知,HEPES可以有效地改善病毒培养液缓冲能力,促进病毒颗粒的稳定性。     

BHK-21细胞规模化培养鸡新城疫病毒工艺的研究和初步应用

为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养，本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株；使用该细胞以初始密度为100×10⁴个/mL接种摇瓶进行培养，并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化；利用摇瓶优化的病毒培养工艺，在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞，接种鸡新城疫病毒；采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗，免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示，在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×10⁴个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×10⁴个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒，同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶，于35℃温度条件下培养64～72 h收获病毒液，鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log...     

不同接毒方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖效果比较

通过对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染Marc-145细胞4种不同接毒方法的比较研究,筛选出一种在规模化生产中既能保证毒价,又能减少工艺流程,提高工作效率,降低污染几率及生产成本的接种方法。结果表明,与其他方法相比,同步接毒法效果最佳,不仅毒价最高,而且繁殖毒液时间缩短,减轻了工作量,节省生产成本。     

鸡源4型禽腺病毒滨州株适应细胞的筛选及培养特性的研究

为探究鸡源禽腺病毒的适应细胞及培养特性,将前期分离保存的1株4型禽腺病毒滨州株,分别接种Vero细胞、QT-35细胞、DF-1细胞和LMH细胞,连续传3代后,通过细胞病变特征和病毒含量,选出最适宜的细胞,并对细胞进行克隆优选。同时研究了该毒株的接毒剂量、接毒后吸附时间和收获时间。结果表明,LMH细胞最适于4型禽腺病毒滨州株的培养。最佳增殖条件为:最佳接毒量为1/1000、接毒后最佳吸附时间为1 h、收毒时间为接毒后36 h。     

带毒传代工艺在狂犬病细胞苗生产中的应用

狂犬病细胞苗的传统生产方法是取长成“ ”的BHK21细胞单层，弃去生长液(血清含量100mL／K)，按1．5万mL细胞培养瓶每瓶40mL的量接毒旋转，使毒液浸润整个细胞面，37℃旋转吸附40～60min，加入2000mL维持液(含血清30mL／L)，37℃旋转培养48h后，调pH至7．2～7．4，继续培养至96～120h，冻毒，收获细胞培养物。传统方法的生产成本高，劳动强度大，种毒使用量大。2004年笔者采用带毒传代工艺生产狂犬病细胞苗，效果较为满意。     

猪流行性腹泻病毒培养的工艺参数优化试验

为了提高猪流行性腹泻病毒的病毒滴度,建立最优的病毒培养条件,对影响病毒培养的细胞培养时间、接毒剂量、收毒时间等条件进行了研究。结果表明:细胞培养时间为主要因素,对于流行性腹泻病毒毒价影响较为显著,细胞培养72 h接毒平均毒价为107.44TCID50/0.1 m L,均高于其他两组;而收毒时间则为次要因素,平均毒价为107.21TCID50/0.1m L;接毒剂量影响不显著,平均毒价为107.08TCID50/0.1 m L,本试验最佳工艺组合为细胞培养72 h接毒、接毒剂量为0.1%、收毒时病变程度为60%。     

水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗保存期试验

对2~8℃条件下保存90,120,150,180,210,240,300,360 d的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗接种水貂进行免疫试验,结果表明:保存300 d的疫苗接种水貂30 d后血清中水貂肠炎细小病毒(MEV)HI抗体均在1∶32以上,免疫水貂强毒攻击均获得100%保护,确定水貂细小病毒细胞灭活疫苗保存期为300 d。该结果为水貂细小病毒细胞灭活疫苗运输和保存提供了理论依据。     

影响鸡传染性法氏囊病毒抗原(HQ株)效价因素的探讨

抗原效价高低是评价疫苗质量的一项重要指标,目前各厂家的法氏囊疫苗免疫效果不佳,其中一个重要原因就是法氏囊抗原效价不高。试验旨在探讨影响鸡传染性法氏囊病毒抗原(HQ株)效价的因素,从而优化生产工艺参数提升抗原效价,从而提升法氏囊疫苗产品的免疫效果。本试验通过对比不同细胞传代比例,维持液pH,接毒量,接毒时间,收毒时间,接毒后培养温度,维持液血清含量生产抗原的病毒效价,从而选择最佳的工艺参数生产法氏囊抗原。结果表明:传代分种比例小细胞密度大的细胞接毒后病毒效价高,接毒后维持液pH7.8比pH 7.4的病毒抗原效价高;1%种毒接毒量效价最高,细胞培养至24~48h接毒,抗原效价差别小;接毒后36h收毒为最佳收毒时间,接毒后细胞培养温度为37℃最佳;接毒后维持液中血清含量为2%时抗原效价最高。综上,本试验获得了鸡传染性法氏囊病毒(HQ株)疫苗的最佳生产工艺参数,为生产出高效价的传染性法氏囊病毒抗原(HQ株)提供基础数据。     

伪狂犬病病毒HB-98株不同保存条件下病毒含量的比较

将同一批次的伪狂犬病病毒HB-98株病毒液与同一条件下冻干生产的成品分别在2℃～8℃和-20℃以下保存,间隔一定时间分别测定其病毒含量。发现无论在何种环境下保存,随着时间的推移,病毒含量趋于下降。但在一定时期内,病毒液在不同保存条件下病毒含量有明显区别,在2℃～8℃保存明显好于在-20℃以下保存;冻干后的成品在两种存放条件下短期存放则无明显区别。