T7噬菌体p10融合蛋白表达及自组装VLP观察

原核表达T7噬菌体p10融合蛋白,PCR扩增p10基因并在基因下游连接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因;将融合基因插入p ET-28a载体,构建重组质粒;用IPTG诱导重组菌表达目标蛋白,通过电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成。结果成功构建了p ET-p10-VP1表达菌株。SDS-PAGE、Western-blot检测显示目标蛋白高效表达并与VP1特异性抗体产生免疫反应。回收p10-VP1蛋白样品经透射电镜观察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌体p10蛋白具有良好的VLP自组装功能,并可用于抗原表位的表面展示。     

T7噬菌体p10融合蛋白表达及自组装VLP观察

原核表达T7噬菌体p10融合蛋白,PCR扩增p10基因并在基因下游连接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因;将融合基因插入p ET-28a载体,构建重组质粒;用IPTG诱导重组菌表达目标蛋白,通过电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成。结果成功构建了p ET-p10-VP1表达菌株。SDS-PAGE、Western-blot检测显示目标蛋白高效表达并与VP1特异性抗体产生免疫反应。回收p10-VP1蛋白样品经透射电镜观察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌体p10蛋白具有良好的VLP自组装功能,并可用于抗原表位的表面展示。     

传染性鼻气管炎病毒gD基因表位的原核表达与纯化

[目的]对牛传染性鼻气管炎病-毒(IBRV) gD基因表位进行原核表达,并对表达产物进行纯化鉴定.[方法]利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C,并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD.将其转入BI21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达.表达的gD重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Western blot分析.[结果]重组表达质粒pET-28a-gD经PCR、双酶切及测序证明构建正确.SDS-PAGE表明,gD蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约48 ku,与预期的蛋白分子量一致.纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg//ml,免疫印迹结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好.[结论]成功表达了gD基因表位蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防IBR基因工程亚单位疫苗的候选抗原.     

牛轮状病毒VP4基因与LTB基因的融合表达及免疫原性研究

PCR扩增轮状病毒VP4基因和大肠杆菌LTB基因编码区,将其克隆至pET32a载体上,构建pET32a-VP4-LTB质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),PCR、酶切鉴定后进一步测序,测序结果表明融合基因片段由2637 bp组成,为编码879个氨基酸残基的多肽。经IPTG诱导和SDS-PAGE检测发现表达产物分子量约为118.9 KD,以包涵体的形式存在。融合蛋白经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫小鼠,结果所产生的抗体效价高于单独VP4蛋白的免疫结果但差异不显著(P0.5),但与对照组相比差异显著。表明所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性,为研制牛轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达和蛋白纯化

利用PCR技术从FPV-HLJ株病毒细胞培养物中扩增VP2基因主要抗原表位区片段VP2’。扩增片段克隆至pMD18-T载体,经核苷酸序列测定确认后,亚克隆于pGEX-6p-1原核表达载体,构建pGEX-6p-VP2’重组原核表达质粒。将该质粒转化至表达菌BL21(DE3)中用IPTG进行诱导表达。表达蛋白采用切胶法纯化,并用SDS-PAGE和Westernblot检测纯化蛋白纯度和抗原特异性。结果表明,VP2基因全长1200bp,编码400个氨基酸。重组菌可表达相对分子量约为66kD的融合蛋白,包括目的蛋白40kD和GST标签26kD。该蛋白以包涵体形式存在,且GST融合蛋白具有良好抗原特异性。     

牛轮状病毒结构蛋白VP4基因的真核表达

[目的]克隆获得牛轮状病毒VP4全基因,并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR技术,从牛轮状病毒总RNA中扩增出VP4基因,将其重组到含有Flag标签的pcDNA3.1(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过Lipofect2000TM转染293T细胞,细胞增殖后经RT-PCR和Western Blot检测VP4基因的表达。[结果]获得了VP4基因的阳性重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP4;转染293T细胞后经RT-PCR和Western Blot检测表明,该基因的重组表达载体构建正确,可在293T细胞内瞬时表达。[结论]VP4基因的重组真核表达载体构建成功并可在真核表达细胞内表达,该研究为VP4基因的DNA疫苗的研发及应用奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。     

牛A组轮状病毒VP4全基因的克隆与原核表达

以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

猪伪狂犬病毒gB和gC蛋白B细胞表位编码序列的融合表达及活性测定

依据猪伪狂犬病毒g B和g C蛋白的B细胞表位编码序列,分别设计g B和g C蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物,利用融合PCR技术,将g B和g C蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为g B-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体p ET28a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白g B-C能够高效表达,重组蛋白的分子质量约为38 ku;经Western blot鉴定分析,小鼠抗His标签单克隆抗体和PRV阳性血清均能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了融合蛋白g B-C,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。     

猪轮状病毒VP4蛋白基因在大肠杆菌中的表达

[目的]研究猪的轮状病毒VP4蛋白基因在BL21大肠杆菌中的表达。[方法]以猪肺脏组织中分离的总RNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应（1it—PCR）技术扩增VP4蛋白的部分基因,将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒PGEX-4T-1-VP4并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。将重组载体PGEx4T-1-VP4转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达和SDS—PAGE分析,并对重组大肠杆菌进行可溶性分析。[结果]对猪肺脏组织中分离的总RNA进行RT—PCR扩增,获得875bp的VP4部分基因,重组质粒PGEX-4T-1-VP4经BamHI和Xho Ⅰ双酶切和测序鉴定后,插入的猪轮状病毒VP4的eDNA编码区序列与已公布的猪GenBank核酸序列比对结果为99．5％;将重组质粒pGEX-4T-1-VP4-一转化至大肠杆菌B121（DE3）中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约58kDa融合蛋白带。[结论]该研究为进一步研究轮状病毒的疫苗研制奠定了基础。     

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。     

犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导表达

利用PCR扩增CPV-2bVP2蛋白的主要抗原表位区基因,并将该基因片段克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,通过诱导表达条件的摸索,实现了VP2蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达,sDs—PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,并利用亲和层析得到融合蛋白。     

猪轮状病毒VP6基因的原核表达载体构建和表达

根据已报道的猪轮状病毒VP6基因序列设计了2对引物,利用pGEM-T-Easy-VP6重组质粒为模板,经PCR扩增获得了1 194 bp的产物。将扩增片段分别插入到pET5α和pGEX-4T-2构建表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)Plyss和ER2566中表达。结果表明:成功构建了重组质粒,而且该片段在大肠杆菌中也成功表达,获得了大小为44 kD的蛋白。     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性

[目的]研究兔出血症病毒（RHDV）VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b（＋）为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。     

猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫研究

将昆明鼠随机分为A,B,C,D4组,各组分别采用含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7,含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组真核表达质粒pcDNA-N,pcD-NA-VP7和pcDNA-N、真核表达载体pcDNA3.1(+),肌肉注射3次,每次间隔2周。首次注射前后定期采血,检测血清抗体和外周血淋巴细胞中CD4+,CD8+T细胞数量的变化。A,C组小鼠血清在首免后第14天即可检出针对RVVP7的阳性抗体(P/N≥2.0)。B组小鼠血清在首免后第39天检出针对TGEVN蛋白的阳性抗体(P/N≥2.0)。A,B,C组小鼠在首免后外周血CD4+、CD8+T细胞数量与D组小鼠相比,在不同时间有显著差异(P<0.05),并明显高于D组小鼠。说明猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫后能诱发机体免疫反应。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

昆明鼠对猪轮状病毒核酸免疫的抗体应答

将昆明鼠随机分为A、B两组,分别肌肉注射含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7和真核表达载体pcDNA3.1(+),每只鼠100μg·(100μL)-1,共免疫3次,每次间隔2周。首次免疫第0,14,21,28,35,39,47,54天采血分离血清用ELISA法检测抗体动态变化。A组小鼠血清在首免后第14天即可检出阳性抗体(P/N≥2.0)。