产PVL金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞内质网应激和自噬的影响

【目的】研究产PV-杀白细胞素（Panton Valentine leukocidin,PVL）金黄色葡萄球菌ATCC49775（产PVL标准菌株）、ΔPVL 49775（PVL基因缺失株）以及体外重组PVL（rPVL）对奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）内质网应激和自噬的影响,为系统阐述金黄色葡萄球菌及PVL对BMECs损伤的分子机制奠定基础。【方法】用感染复数（MOI）为30的金黄色葡萄球菌菌株ATCC49775和ΔPVL 49775感染BMECs,于感染后3和6 h取样;用100 ng/mL rPVL处理BMECs,于处理后1,3和6 h取样;以未处理的BMECs为对照（CK）。用免疫荧光法检测样品BMECs细胞的自噬体荧光强度;提取样品细胞的总蛋白,以GADPH为内参蛋白,采用Western blot法检测各处理组内质网应激相关蛋白（CHOP和GRP78）和自噬相关蛋白（LC3 Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62）的相对表达量。【结果】ATCC49775、ΔPVL 49775感染后不同时间,BMECs自噬体荧光强度均极显著（P＜0.01）高于CK,内质网应激相关蛋白（CHOP和GRP78）和自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62）的表达水平也大多显著(P<0.05)或极显著（P＜0.01）高于CK;同一处理时间下, ATCC49775感染组自噬体荧光强度和相关蛋白表达水平均显著(P<0.05)或极显著（P＜0.01）高于ΔPVL49775感染组。 rPVL处理后不同时间,BMECs的自噬体荧光强度均极显著（P＜0.01）高于CK,内质网应激和自噬相关蛋白的表达水平大多极显著（P＜0.01）高于CK。【结论】产PVL金黄色葡萄球菌ATCC49775、ΔPVL 49775以及rPVL均加剧了BMECs的内质网应激和自噬,说明PVL在金黄色葡萄球菌感染BMECs的过程中有重要作用。     

视黄醇对大肠杆菌诱导的大鼠乳腺上皮细胞NF-κB信号通路的抑制作用

为探讨视黄醇对大肠杆菌诱发的大鼠乳腺上皮细胞炎症反应的影响,原代培养大鼠乳腺上皮细胞,试验组预先经视黄醇处理24 h后,对照组和试验组分别经大肠杆菌处理30 min和60 min,收集细胞和上清液。结果显示,大肠杆菌诱发能显著提高TLR4和NF-κB表达,进而促进促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的释放以及炎性介质iNOS(诱导型-氧化氮合酶)的表达。视黄醇处理能抑制NF-κB表达,进而降低炎性细胞因子和炎性介质的释放和表达,从而达到保护乳腺上皮细胞的作用。     

奶牛金黄色葡萄球菌乳腺炎及其疫苗的研究进展

金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的重要致病菌,笔者对奶牛乳腺炎、金黄色葡萄球菌及其致病机理、金黄色葡萄球菌乳腺炎疫苗的研究等进行了综述,并对新型疫苗的研究进行了展望。     

金黄色葡萄球菌诱导牛原代乳腺上皮细胞的凋亡

【目的】观察金黄色葡萄球菌能否诱导牛原代乳腺上皮细胞发生凋亡。【方法】先以新鲜牛奶为材料分离培养牛乳腺上皮细胞并鉴定,然后用金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞,采用普通光镜和扫描电子显微镜观察金黄色葡萄球菌诱导牛乳腺上皮细胞凋亡的形态学变化;用流式细胞仪（Annexin V/PI双染法）定量检测金黄色葡萄球菌感染对牛乳腺上皮细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR检测细胞凋亡通路中关键蛋白caspase 3和caspase 8的变化情况。【结果】从乳汁中分离的细胞经原代培养后,细胞呈典型的铺路石状,细胞表层可产生大小不等的乳滴,RT-PCR法扩增出乳腺上皮细胞的骨架蛋白8特异性条带;免疫荧光细胞染色法结果显示分离培养的牛乳腺上皮细胞表达角蛋白8;金黄色葡萄球菌感染牛乳腺上皮细胞3 h后,可诱导牛乳腺上皮细胞发生凋亡,表现为细胞核皱缩,染色质边缘化和细胞浆内空泡增多等典型凋亡特征;Annexin V/PI双染法检测后发现,与对照组相比,感染组细胞凋亡率明显升高,差异极显著（P﹤0.01）;与对照组相比,感染组细胞caspase3及caspase 8表达量明显增高。【结论】金黄色葡萄球菌可以诱导牛原代乳腺上皮细胞凋亡,具有细胞凋亡的典型形态特征和生化特性,凋亡通路可能涉及caspase 3和caspase 8参与的外源性凋亡途径。     

新疆牛源金黄色葡萄球菌抗菌素敏感性调查

[目的]了解新疆奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的药物敏感性情况,为该病治疗的临床用药提供参考。[方法]2009年以来对乌鲁木齐市、昌吉、呼图壁、奎屯、伊犁和库尔勒6地区16个奶牛养殖场乳房炎奶样分离金黄色葡萄球菌,用纸片扩散法进行抗菌素敏感性检测。[结果]共分离143株金黄色葡萄球菌,临床药敏试验显示,新疆70%以上分离株对红霉素、青霉素、复方新诺明、多西环素、四环素耐药,40%的菌株对氯霉素、环丙沙星和庆大霉素耐药;并且67.1%菌株同时对5种以上抗菌素耐药,10.5%的菌株对所测试的10种抗菌素耐药。此外,发现了19.6%的牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。[结论]新疆奶牛乳房炎病例中的金黄色葡萄球菌对当前临床上允许使用的多种类型的抗菌素呈现严重的多重耐药,使用抗菌素进行奶牛乳房炎的防治难以取得理想的疗效。这类菌株的存在和蔓延将对新疆奶牛养殖业的健康发展和奶制品的安全构成威胁,建议在选择奶牛乳房炎治疗的抗生素时,应以流行菌株的耐药性为依据。     

聚合酶链式反应(PCR)技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌

根据金黄色葡萄球菌特异性STAA-Aul基因序列,设计、合成了一对引物,运用聚合酶链式反应(PCR)技术从10头患有奶牛乳房炎的奶牛奶样中扩增得到8个大小为420 bp的DNA产物;阴性样品中未扩增到产物。测定了其中2个DNA片段的核酸序列,确定为金黄色葡萄球菌的STAA-Aul基因。     

石墨材料对黑曲霉和金黄色葡萄球菌生长的不同作用

向PDA培养基中加入膨胀石墨观察黑曲霉的生长,向牛肉膏蛋白胨培养基中加入膨胀石墨观察金黄色葡萄球菌的生长。结果发现:不加膨胀石墨的PDA培养基中黑曲霉菌落直径小于加入膨胀石墨的培养基中黑曲霉菌落直径。不加膨胀石墨的牛肉膏蛋白胨培养基中金黄色葡萄球菌落直径大于加入膨胀石墨的培养基中金黄色葡萄球菌落直径。证实在PDA培养基中膨胀石墨对黑曲霉生长有促进作用,而在牛肉膏蛋白胨培养基中膨胀石墨的加入对金黄色葡萄球菌的生长有抑制作用。     

MSL抗菌肽对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的损伤作用研究

通过MSL抗菌肽(MSL)对细菌细胞膜的损伤作用研究,确定该抗菌肽的作用靶点。在1×108个/m L的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌悬液中,分别加入MSL至终浓度为1×MIC,37℃保温孵育,分别于0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min、180min、240min离心收集上清液,检测各时间点蛋白浓度,分析蛋白浓度变化规律;分别在对数生长期的金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌悬液中加入MSL至终浓度为1×MIC,37℃保温孵育60min后,利用透射电镜观察分析细菌结构的变化。结果,MSL与2种细菌接触后均可引发胞液外流;透射电镜观察发现,MSL可造成绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜破损,胞浆内电子密度降低,染色质聚集,严重者细胞崩解结构不清,说明MSL对G+和G-细菌细胞膜均可造成损伤,证明细菌细胞膜是MSL作用的靶点之一。     

新疆南疆地区奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌生物膜形成及其相关基因的检测

为了揭示新疆南疆地区奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌生物膜形成情况,采用微孔板半定量法和PCR技术检测分离自新疆南疆地区奶牛乳腺炎乳样中金黄色葡萄球菌生物膜的形成能力和生物膜形成相关基因。结果表明:27%的实验菌株可形成不同强度的生物膜,且生物膜形成相关基因分布较为复杂,给本地区奶牛乳腺炎的防制带来很大困难。     

苦参碱对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及抗氧化能力的影响

【目的】探究苦参碱对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。【方法】利用含0(A组),25(B组),50(C组),75(D组)和100μg/mL(E组)苦参碱的培养基培养奶牛乳腺上皮细胞。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测BMECs活性,采用流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测苦参碱对BMECs凋亡的影响,并检测苦参碱对BMECs抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的影响,采用real-time PCR对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量进行检测。【结果】用药5d时,低质量浓度(25和50μg/mL)苦参碱对BMECs增殖具有促进作用,高质量浓度(75和100μg/mL)苦参碱对细胞增殖具有抑制作用;B~E组BMECs的凋亡率均极显著高于A组(P0.01);B~E组BMECs培养上清液中NO和乳酸脱氢酶(LDH)水平明显高于A组。B~E组BMECs的过氧化氢酶(CAT)活性均比A组高,其中C组极显著高于A组(P0.01);B~E组的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均极显著高于A组(P0.01),E组的超氧化物歧化酶(SOD)水平极显著高于A组(P0.01),各组MDA含量无显著性差异。与A组相比,苦参碱上调了B~E组BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量。【结论】低质量浓度苦参碱能够促进BMECs增殖,高质量浓度苦参碱则会抑制BMECs增殖;不同质量浓度苦参碱均可提高BMECs的抗氧化能力,其中50μg/mL苦参碱提高BMECs抗氧化能力的效果最明显。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素的研究进展

目的α-溶血素在金黄色葡萄球菌(金葡菌)肺炎的感染过程中起着非常重要的作用,可作为治疗金葡菌肺炎的新靶标。因此,研究百里香酚对金葡菌α-溶血素表达的影响具有重要意义。方法测定最小抑菌质量浓度(MIC)和生长曲线并进行了溶血试验、蛋白免疫印迹分析、荧光定量PCR以及细胞毒性试验。结果百里香酚对金葡菌USA300的MIC为256 μg/mL,亚抑菌质量浓度的百里香酚(32 μg/mL)可下调金葡菌hla和RNAIII的转录水平,降低α-溶血素的表达,对溶血素介导的肺癌上皮细胞A549损伤具有保护作用。结论百里香酚具有成为新型抗金葡菌感染药物的潜力。     

金黄色葡萄球菌的临床分布及耐药性分析

目的探究扁桃酸对金黄色葡萄球菌分选酶A (SrtA)活性的抑制作用及其分子机制。方法采用二倍肉汤稀释法和平板涂布法研究扁桃酸对金黄色葡萄球菌的体外抑制作用;测定金黄色葡萄球菌在含有不同质量浓度扁桃酸的培养基中的生长曲线;采用结晶紫染色法测定扁桃酸对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响;通过荧光共振能量转移试验(FRET)、分子对接技术和分子动力学模拟技术研究扁桃酸对SrtA活性的抑制作用及其分子机制。结果扁桃酸对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均大于1 024 μg/mL,在试验质量浓度范围内(0、64、128、256、512和1 024 μg/mL)对金黄色葡萄球菌及其生长基本没有影响;不同质量浓度扁桃酸对金黄色葡萄球菌生物膜减少的总量有细微差异并形成一定抑制作用,并呈质量浓度依赖性;扁桃酸对SrtA活性有一定的抑制作用,其IC₅₀为(66.15±24.39) μg/mL;扁桃酸通过多种分子间作用力与Pro-163、Val-166、Gly-167、Val-168、Ile-199和Leu-169残基紧密结合,使SrtA的构象改变从而降低活性。结论扁桃酸可以与SrtA的活性中心紧凑结合并相互作用形成稳定的复合物,最终抑制SrtA的生物活性,具有成为抗金黄色葡萄球菌感染抑制剂的潜力。     

小檗碱体外抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的研究

目的 研究小檗碱体外抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）活性。方法 运用琼脂扩散法、液体稀释法测定并分析小檗碱对MRSA的抑菌环大小、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）;运用96孔酶标板结晶紫法测定并分析小檗碱对MRSA的最小生物膜清除浓度（MBEC）。结果 与DMSO比较,小檗碱与氯霉素（阳性对照药物）可显著增加MRSA的抑菌环半径（P<0.01）,小檗碱对MRSA的MIC为0.2 mg/mL,MBC为0.4 mg/mL;小檗碱对MRSA的MBEC为0.2 mg/mL。结论 小檗碱对MRSA有比较明显的抗菌、抑菌作用,其效应机制可能与其抑制细菌生物膜的形成有关。     

百里香酚对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制

【目的】探讨百里香酚对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌作用机制,为开发高效低毒的抗MRSA药物提供可靠的理论依据。【方法】采用微量肉汤稀释法和菌落计数法测定百里香酚对MRSA标准菌株USA300的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC);通过测定菌液电导率和DNA含量确定百里香酚对USA300细胞膜的影响;通过SDS-PAGE检测百里香酚对USA300可溶性蛋白质代谢的影响;利用透射电镜观察经百里香酚处理后USA300菌体细胞的超微结构;通过结晶紫染色法测定百里香酚对USA300生物被膜形成的影响。【结果】百里香酚对USA300具有一定的抑制作用,其MIC和MBC均为256 mg·L~(–1)。与对照组相比,512 mg·L~(–1)百里香酚作用菌体1 h后,菌液电导率增加18.08%±1.80%,DNA外渗量增加(123.40±8.06) mg·L~(–1),作用24 h后,菌体可溶性蛋白质含量比对照组降低68.20%±0.15%。百里香酚对USA300细胞壁和细胞膜具有破坏作用并干扰其正常的二分裂,亚抑菌浓度下对生物被膜的形成具有一定抑制作用。【结论】百里香酚通过改变菌体细胞膜通透性,干扰蛋白质代谢和正常的二分裂来抑制细菌的生长,亚抑菌浓度下能够在不影响细菌生长的前提下抑制其生物被膜的形成。百里香酚具有开发为抗MRSA药物的潜力。     

金黄色葡萄球菌SSL7蛋白对补体系统的作用分析

为探究金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白(Staphylococcal superantigen-like proteins,SSLs)与补体系统相关的生物学特征,利用原核表达系统表达SSL7重组蛋白,并通过补体杀伤试验、Western Blot以及Pull-down对其有关补体系统的生物学特征进行研究。结果表明:1)重组蛋白SSL7可在大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)系统中大量可溶性表达,大小约25ku;2)SSL7可阻断新鲜兔血清对大肠杆菌DH5α的补体杀伤作用;3)SSL7抑制补体激活后攻膜复合体(Membrane attack complex,MAC)的形成,新鲜兔血清无法在金黄色葡萄球菌NCTC 8325菌体表面形成MAC沉积;4)SSL7能捕获健康人血清(Human normal serum,HNS)中的补体C5,阻断补体系统的激活。综上,金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白SSL7可以通过特异性结合补体C5阻断补体级联反应,逃避宿主免疫应答以达到致病的目的,为进一步探究SSL7的感染机制、揭示SSLs蛋白功能奠定基础。     

CRISPR/Cas系统对金黄色葡萄球菌耐药及毒力基因的影响

【目的】了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”) Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布情况,分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的影响。【方法】从公共数据库获取组装完整的金葡菌基因组575个,利用生物信息学方法,统计CRISPR结构的携带情况,菌株多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)型别分布和菌株耐药基因、毒力基因的分布情况;对CRISPR结构阳性(CRISPR+)和CRISPR结构阴性(CRISPR-)的金葡菌耐药基因和毒力基因携带数目进行差异显著性分析。同时对实验室60株金葡菌二代测序数据进行分析,验证公共数据库分析结果。对实验室60株金葡菌中原噬菌体、接合质粒的携带情况进行统计,讨论CRISPR结构对菌株原噬菌体和接合质粒的影响。【结果】基因组组装完整的575株金葡菌中,有62株携带CRISPR结构(CRISPR+),513株不携带CRISPR结构(CRISP...     

金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶生理功能分析

为了研究金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶的功能和作用,克隆该基因的全长序列,在一氧化氮合酶基因缺陷菌株的基础上,构建一氧化氮合酶过表达菌株,进行表型验证,研究NO对细菌表型的影响。结果显示:一氧化氮合酶缺失使细菌自溶速率加快,抗氧化杀伤能力减弱,生物被膜生成能力降低、缺失和过表达均会影响细菌正常的生长周期和速率。外源性NO对野生菌株、敲除菌株和过表达菌株生物被膜有不同影响显示,金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶还参与了外源性NO对生物被膜的调控。一系列表型结果表明:金黄色葡萄球菌内源性NO作用不仅仅阻断Fenton反应、增强过氧化氢酶活性,还可以作为一种信号分子调控细菌基因的转录和表达。     

Detection of Staphylococcus aureus in Dairy Products by Polymerase Chain Reaction Assay

A polymerase chain reaction （PCR） assay was employed for direct detection of Staphylococcus aureus without enrichment in dairy products. A solvent extraction procedure was successfully modified for the extraction of Staphylococcus aureus DNA from artificially contaminated whole milk, skim milk, and cheese. A primer targeting the thermostable nuclease gene （nuc） was used in the PCR. A DNA fragment of 279 bp was amplified. The PCR product was confirmed by DNA sequencing. In this study, the PCR, GB-4789.10-94, Perifilm RSA.Count Plate, and Baird-Parker ＋ RPF Agar were compared. The sensitivity of the PCR was 10 CFU mL^-1 of whole milk, skim milk, and 55 CFU g^-1 of cheese. The developed methodology allowed for detection of Staphylococcus aureus in dairy products in less than 6 h. The time taken for the development of this PCR assay was 12-24 h, less than the time taken by the general PCR assay using the enrichment method, and the coincidence rate of this developed PCR was 94.3%, the sensitivity was 100%. It was a rapid, sensitive, and effective method for PCR to detect Staphylococcus aureus in milk and milk products.     

重组金黄色葡萄球菌FnbpA亚单位疫苗的研制

【目的】制备金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)基因工程亚单位疫苗,并以小白鼠为试验模型,检测其免疫保护效果。【方法】诱导表达FnbpA,经组氨酸标签亲合纯化后用Bradford法测定纯化的目的蛋白的含量,并检测其黏附活性及对动物的安全性。制备FnbpA亚单位疫苗,经无菌检验及安全检验后,进行免疫保护试验,用ELISA方法检测被免疫小鼠血清中的抗体效价,通过腹腔攻毒试验检测疫苗的免疫保护力。【结果】纯化的目的蛋白在80 ku处出现单一条带,蛋白质量浓度为0.245 mg/mL。细菌黏附抑制试验发现,经FnbpA蛋白预处理过的MDBK细胞黏附的金黄色葡萄球菌数较对照极显著减少;动物安全性试验显示,小鼠注射FnbpA亚单位疫苗后均健活,表明制备的FnbpA亚单位疫苗安全性良好。所有免疫组小鼠于首免后7 d即可在血清中检测到特异性抗体,抗体效价逐渐上升,在21 d达到最高值,之后逐渐降低。【结论】纯化的FnbpA蛋白达到了电泳级纯度,且依然保持良好的黏附活性;制备的FnbpA亚单位疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律,且表现出良好的免疫保护力。