一株猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的分离与鉴定

试验旨在分离并鉴定从发病猪场分离的一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株。从某疫情猪场病猪体内分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-CHD。该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),病毒滴度达10^-6 TCID50/0.1 mL,在Vero与BHK-21细胞上不出现细胞病变。采用间接免疫荧光法(IFA)检测病毒抗原分布在细胞浆中。与VR2332、CH-1a、HUN4序列比对及系统进化树分析结果表明,该分离株属于美洲型PRRSV;与PRRSV VR2332、CH-1a等比对,Nsp2基因序列在2780—2782 nt有3个核苷酸小缺失和2933—3019 nt的87个核苷酸大缺失,属PRRSV变异株。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD07b株的分离鉴定及Nsp2基因同源性分析

在某集约化猪场采集疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病死猪的肺、淋巴结等病料,进行检测,将RT-PCR检测结果为阳性的病料处理后接种Marc-145细胞,培养72～96 h后细胞单层出现明显的CPE。收获病毒经RT-PCR方法检测,并将此PCR产物经纯化后连同引物送相关公司进行测序,结果显示,该病毒为繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因缺失株,将该病毒命名为HPPRRSV-GD07b株。将GD07b株序列与国内外19株PRRSV Nsp2基因进行比较分析,结果表明,该毒株Nsp2基因与CH-1a株等4株PRRSV经典株同源性较低,为60.5%～81.6%;而与14株变异株同源性较高,为90.6%～98.9%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GD-ZQ变异株的分离及遗传变异分析

用RT-PCR方法从某猪场病猪体内分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),命名为PRRSV GD-ZQ株,可致Marc-145细胞病变。细胞分离培育病毒至增殖性能稳定后,分别扩增分离病毒的Nsp2、ORF3、ORF5基因并测序,绘制进化树比较分析遗传进化。结果显示分离毒株的Nsp2、ORF3、ORF5基因序列与美洲型VR-2332、CH-1a等毒株核苷酸序列相似性在89.0%~95.8%之间,与欧洲毒株LV的相似性在48.2%~49.3%之间,遗传进化分析显示该毒株与CH-1a株处于同一分支,分离毒株的Nsp2序列与以HEB1为代表的PRRSV变异株相似性在98.3%~99.4%之间。该病毒在细胞盲传5代能产生稳定规律细胞病变(CPE),且第5代病毒TCID₅₀达10^-5.6／0.1 mL。进化分析结果显示GD-ZQ分离株是PRRSV变异株,具有"高热病"PRRSV毒株的变异特点,为了解PRRSV在时间上和分子水平上的遗传变异规律、变异幅度和变异范围奠定基础。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199 bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185 bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及其体外传代遗传变异分析

从临床"高热综合征"病例分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代和蚀斑克隆.培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-HBR.该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),随传代次数增加毒价显著提升,第45～60代毒价测定达107.5TCID<,50/mL.采用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测病毒抗原分布在细胞浆中;电镜观察到的病毒粒子呈圆形,直径约50 nm～55 nm.分离株Nsp2基因序列中第483位和535～563位氨基酸存在缺失,属PRRSV变异株.该毒株Nsp2基因序列比较发现,经细胞传40代后第3 115位核苷酸处插入12个碱基序列(GAGATCGCCTTT).用该毒株第5代培养物滴鼻接种试验猪(1.0×104.5TCID<,50),临床表现为持续高热(≥40.5℃,9 d～12 d)、食欲下降、精神萎靡、消瘦、眼睑水肿、体表淋巴结肿大等,发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10).研究表明,PRRSV-HBR分离株对靶动物具有高致病力,培育的细胞适应毒株体外繁殖能力稳定,并产生了标志性基因突变,为该病毒致病机理、遗传变异规律、疫苗免疫等研究奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒江苏株的分离与鉴定

从暴发猪高热病的江苏盐城地区某养殖户送检病料中分离到一株致Marc-145细胞病变的病毒,细胞培养物裂解上清经浓缩、负染后电镜观察可见直径约50 nm,有囊膜的球形病毒粒子;间接免疫荧光试验结果表明,该分离株与美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清反应发出强特异性荧光;以特异性引物对分离的病毒进行RT-PCR扩增于600 bp～700 bp出现单一条带,序列分析显示Nsp2缺失了87 bp.结果表明,该分离株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株,暂命名为JYC.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒传统毒株与变异毒株的鉴别诊断

从山东各地猪场采集了50份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)感染的病料,采用RT-PCR技术扩增出PRRS病毒(PRRSV)的ORF7基因和Nsp2基因,并对Nsp2基因进行了序列同源性比较和遗传进化树分析,从RT-PCR阳性病料中进行病毒分离,然后应用Nsp2单克隆抗体对分离毒株进行鉴别诊断。结果表明,从8份病料中同时扩增出病毒的ORF7基因和Nsp2基因,序列分析显示其中6株病毒的Nsp2缺失30个氨基酸,与Nsp2单克隆抗体不发生反应,属于变异毒株;另外两株病毒的Nsp2未见氨基酸缺失,与Nsp2单克隆抗体发生特异性反应,属于传统毒株。序列同源性和系统进化分析表明,6株变异毒株与其他高致病性毒株亲缘关系很近,而与经典毒株的遗传距离较远。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒特殊变异株LD812的分离与序列分析

从2008年送检的病猪病料中分离到1株致细胞病变代次、时间以及细胞病变形态与典型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)培养特性不同的PRRSV(LD812株)。对LD812株的Nsp2和ORF5基因进行测序发现,该株病毒与标准HP-PRRSVJXA1株(与VR2332相比,JXA1Nsp2基因的第478、538～566位氨基酸缺失,缺失形式为1+29个氨基酸)的Nsp2基因同源性为98.3%,LD812分离株Nsp2基因上第475～520和538～566位氨基酸缺失,缺失形式为46+29个氨基酸,比JXA1株在1号缺失位多缺失45个氨基酸;LD812株ORF5基因序列与JXA1株相比仅有8个核苷酸的点突变。结合该毒株的临床特征、细胞培养及分子特性,推测LD812为一弱毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒传统毒株与变异毒株的鉴别诊断

从山东各地猪场采集了50份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)感染的病料,采用RT-PCR技术扩增出PRRS病毒(PRRSV)的ORF7基因和Nsp2基因,并对Nsp2基因进行了序列同源性比较和遗传进化树分析,从RT-PCR阳性病料中进行病毒分离,然后应用Nsp2单克隆抗体对分离毒株进行鉴别诊断.结果表明,从8份病料中同时扩增出病毒的ORF7基因和Nsp2基因,序列分析显示其中6株病毒的Nsp2缺失30个氨基酸,与Nsp2单克隆抗体不发生反应,属于变异毒株;另外两株病毒的Nsp2未见氨基酸缺失,与Nsp2单克隆抗体发生特异性反应,属于传统毒株.序列同源性和系统进化分析表明,6株变异毒株与其他高致病性毒株亲缘关系很近,而与经典毒株的遗传距离较远.     

猪繁殖—呼吸综合征病毒的形态学

利用电子显微技术，对从上海某发病猪场分离到3株猪繁殖－呼吸综合征病毒（PRRSV）和标准美洲株（ATCC－VR2332）进行了形态特征的比较。结果表明，这4株病毒形态特征无显著差异。负染显示该病毒以球形为主，具有囊膜，囊膜上有纤突，大小为60－85nm。超薄切片可见病毒粒子大量存在于细胞浆内，有囊膜的直径为60－80nm，没有囊膜的直径为40－50nm，在细胞的线粒体，高尔基体和双基核膜内可见病毒粒子。在病毒增殖的同时，Marc-145细胞的显微结构逐渐发生破损，显示病毒的释放是通过破坏细胞膜结构的完整性来实现的。     

云南景洪帕利亚姆亚群达圭勒病毒的分离与鉴定

为了解牛感染帕利亚姆亚群达圭勒病毒（D’Aguilar virus,DAGV）情况,本研究应用BHK21细胞对2019年云南省景洪市采集的健康黄牛血液样品进行盲传病毒分离,对出现细胞病变的样品进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进行S2、S3、S7基因序列测定和比对分析。结果显示,有5个血液样品可致BHK21细胞病变,电镜观察到完整病毒颗粒呈球形,直径约50 nm;琼脂糖凝胶电泳结果发现5株新分离病毒基因组为10节段,呈现3-3-4的电泳带型特征,其带型特征与2014年在云南分离到的DAGV V106/YN/2014毒株相似;5株病毒S2、S3、S7基因核苷酸、氨基酸序列相似性均为100%,S3、S7片段核苷酸和氨基酸序列与中国本土分离的帕利亚姆亚群病毒（Palyamserogroup virus,PALV）毒株相似性最高;S2片段氨基酸与核苷酸序列与日本分离的DAGV相似性最高。S2、S3、S7基因遗传进化分析结果显示,5株新分离毒株间基因相似度为100%;5个毒株的S7与S3基因序列均与中国本土分离的已知部分PALV毒株在同一分支,亲缘关系较近,提示这5株毒株为PALV;5株毒株S2片段核苷酸序列与日本分离的部分DAGV毒株位于同一分支上,亲缘关系较近,进一步证实这5株毒株为PALV DAGV。本研究成功分离到5株DAGV毒株,并进行了基因片段遗传进化分析,为进一步开展DAGV流行病学研究提供基础。     

IBV AH1-99分离株N基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术成功扩增出IBV AH1-99分离株的N基因全长cNDA,将其克隆到pMD18-T载体上。经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得该分离株N基因的重组质粒。序列分析结果表明,分离株N基因全长1 230个核苷酸,编码409个氨基酸。同部分IBV参考毒株相比,核苷酸同源性为85.8%~89.9%,氨基酸同源性为86.6%~91.0%,在进化关系树中,AH1-99与国内分离株X、LX4亲缘关系较近。     

云南边境地区帕利亚姆血清群中山病病毒的分离与鉴定

【目的】 了解西南边境地区牛感染中山病病毒（Chuzan virus,CHUV）的情况。【方法】 应用BHK21细胞对云南景洪、江城采集的312份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,对出现细胞病变的毒株进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进行S7、S2基因序列测定和比对分析。【结果】 4份血液样品可致BHK21细胞病变,电镜观察病毒颗粒呈球形,直径约50 nm;琼脂糖凝胶电泳发现,4株分离毒株基因组为10节段,带型为"3-3-4",与2012年云南师宗分离的CHUV SZ187毒株相似;4株病毒S7、S2基因核苷酸序列相似性分别为98.7%~99.7%和97.9%~99.1%;S2基因片段核苷酸和氨基酸序列与中国本土分离的SZ187、GHN-GS-16等毒株相似性最高;S7基因片段核苷酸和氨基酸序列与日本分离的ON-1/E/18、ON-3/E/17及中国本土的SZ187、GHN-GS-16等毒株的相似性最高。S7、S2基因遗传进化分析结果显示,4株新分离毒株亲缘关系最近;4株毒株的S7基因序列与中国本土和日本分离的已知帕利亚姆血清群病毒（Palyam serogroup virus,PALV）毒株位于同一分支,提示4株毒株为PALV,且形成一簇,有一定的地域性;4株毒株S2基因片段核苷酸序列与中国本土分离的CHUV位于同一分支,亲缘关系较近,进一步证实这4株毒株为CHUV。【结论】 本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到CHUV毒株,为CHUV在中国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据。     

猫疱疹病毒1型的分离鉴定及gD基因序列分析

为研究猫疱疹病毒1型(FHV-1)的分子流行病学特征,对2016年-2017年从洛阳及天津地区多家宠物医院收集的具有上呼吸道感染症状的病猫眼鼻拭子样品,用FK-81细胞进行病毒分离,通过间接免疫荧光试验、电镜形态观察和gD基因测序分析等方法鉴定所分离的病毒,并进行病毒体外生长动力学研究。结果显示,病料在FK-81细胞上接种后24 h^36 h呈现变圆、融合、局灶性堆积聚团和脱落等细胞病变;分离毒株可被FHV-1单克隆抗体特异性识别;电镜下可观察到病毒粒子呈圆形、有囊膜、直径约130 nm,具有疱疹病毒科的典型形态特征,将所分离到的5株FHV-1分别命名为2016TJ1株、2016TJ2株、2017LY1株、2017LY2株和2017LY3株;病毒一步生长曲线测定结果显示,接种后12 h^36 h病毒快速增殖,40 h^60 h病毒滴度达到高峰,72 h病毒滴度开始下降;5株FHV-1 gD基因序列之间的同源性为100%,核酸序列高度保守且与国内外流行株及疫苗株的同源性极高。研究结果为我国宠物猫群中FHV-1的病原分离、分子流行病学调查等研究积累了资料。     

1株库蠓源版纳病毒的分离与全基因组序列分析

为分析云南省虫媒病毒的种类与遗传特征,在云南省师宗县采集库蠓进行病毒的分离与鉴定;通过全长cDNA扩增与高通量测序技术获取病毒全基因组序列,进行序列比对与系统发生树构建。结果显示,从采集的库蠓样本中分离出1株可在C6/36细胞上引起细胞病变的毒株（YNSZ043）,病毒基因组为分节段双链RNA,琼脂糖凝胶电泳呈"2-4-3"的带型特征;电镜观察可见直径为70~80 nm,呈"指环状",表面具有纤维突起的病毒粒子。全基因组测序结果显示,YNSZ043毒株为版纳病毒（Banna virus,BAV）,基因组大小为20 683 bp,由Seg-1（3 762 bp）至Seg-12（861 bp）12个基因节段组成,与中国BAV毒株各基因节段的核苷酸序列相似性在64.8%~99.6%之间,氨基酸序列相似性在58.8%~100%之间,在系统发生树上YNSZ043毒株与中国分离的BAV聚为一簇,形成独立的中国进化支系。对决定BAV基因型的Seg-12分析结果显示,YNSZ043毒株属于A2基因型,该毒株的Seg-5/VP5与越南分离BAV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性高达97.1%和97.6%,表明该毒株的Seg-5基因节段很可能与越南毒株之间发生了基因重配。研究结果丰富了中国BAV的基因组序列,为开展云南省BAV的流行病学研究提供了参考。     

一株肾型鸡传染性支气管炎病毒的初步分离鉴定

从哈尔滨市某肉鸡养殖场疑似传染性支气管炎的病死鸡中分离到1株肾型IBV,并对其进行鸡胚矮小化、血凝性、电镜下特征、新城疫干扰试验、致病性等生物学鉴定和N基因的RT-PCR鉴定。结果表明,该病毒分离株在鸡胚上传至第四代(F)4开始出现死亡或侏儒胚;病毒不凝集鸡红细胞;透射电镜下可见多呈球形、直径约80～120nm的病毒粒子,具有冠状病毒的典型形态特点;该病毒可干扰新城疫LaSota株在鸡胚中的增殖;将分离毒第4代尿囊液接种于6日龄雏鸡,7d后开始出现死亡,死亡率高达67%(6/9),病死鸡剖解后可见肾脏明显肿大、苍白,具有传染性支气管炎的典型病变;分离毒第5代尿囊液经N基因特异性RT-PCR获得大小约438bp的目的片断。初步确定所分离病毒为肾型IBV。     

犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了研究当前犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）国内流行株的遗传变异情况,试验从北京某宠物基地采集疑似CPV感染死亡犬的肠道组织,无菌处理病料后,用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学和攻毒试验进行鉴定。结果表明,病毒在F81细胞上出现明显的细胞病变（CPE）,电镜观察可见直径20 nm左右的病毒粒子,血凝效价1：256,PCR鉴定在570 bp处有特异性条带,证明分离出1株CPV,命名为CPV-BJ03/17。全基因组测序分析表明,病毒基因组全长4 620 bp,提交GenBank,登录号为：MF134808;该毒株与广东（SC02/2011）、深圳（CPV-s5）和甘肃（CPV-LZ1）等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.7%。VP2氨基酸序列分析表明,CPV-BJ03/17分离株确定为New CPV-2a亚型,主要氨基酸位点与近期分离株BJ15-1等相比无明显变化。动物回归试验表明,CPV-BJ03/17为CPV强毒株。本研究分离出1株CPV强毒株,通过比较CPV的流行情况和遗传变异规律,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。     

猪伪狂犬病病毒GZYY2015变异株的分离鉴定

本试验旨在从贵州省贵阳市云岩区某养猪场送检的经检测为猪伪狂犬病（PR）的样品中分离猪伪狂犬病病毒（PRV）。用细胞接毒试验、理化试验和透射电镜观察等方法分离、鉴定病原,测定病原的毒价后进行动物试验和gD、gE基因序列比对分析。结果显示,细胞接毒试验成功分离能致Vero细胞产生典型病变的PRV。理化试验表明,该分离毒株对5-碘脱氧尿核苷（idoxuridine,IUDR）和有机溶剂氯仿敏感,不耐酸和热。在透射电镜下可见近圆形、有囊膜、150~160 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体,有实心和空心2种形态;动物试验表明,该毒株对兔具有较强的致病性,可导致接种部位奇痒;核酸鉴定结果表明,扩增获得的PRV gD基因开放阅读框（ORF）为1 209 bp,gE基因ORF为1 740 bp。GenBank比对结果显示,gD基因与PRV JS 2012株（登录号：KP257591）、PRV HNB株（登录号：KM189914.3）核苷酸序列相似性均为99.8%,与疫苗株Bartha-K61（登录号：JF797217.1）相似性为98.7%;gE基因与PRV JS2012株（登录号：KP257591）、PRV HNB株（登录号：KM189914.3）和PRV Qihe547（登录号：KU056477）核苷酸序列相似性均为99.9%。基于gD、gE基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析发现,gD、gE基因与国内变异株均位于同一进化分支,对gE基因的遗传变异性分析结果表明,该分离毒株符合PRV变异株的变异模式。本试验结果表明,成功分离PRV变异株,可为贵州省PRV的流行病学遗传进化分析及免疫防控等提供参考。