蛋黄果SCoT-PCR反应体系的建立与优化

为建立和优化蛋黄果SCoT-PCR反应体系,以“仙桃1号”蛋黄果为试材,SCoT1为引物,采用L₁₆(4⁵)正交试验,对影响SCoT-PCR反应的DNA、Mg²⁺、dNTPs、引物及Taq聚合酶等因素进行优化;并选用3份地理位置相距较远的蛋黄果种质为模板,对优化反应体系进行验证。结果表明,不同因素对蛋黄果SCoT-PCR反应体系的影响存在差异,但不显著,其中最大的影响因素是Taq聚合酶含量,其次是dNTPs浓度、模板DNA含量、引物浓度和Mg²⁺浓度。蛋黄果SCoT-PCR最佳反应体系(20μL)为模板DNA 80 ng、3 mmol/L Mg²⁺、0.25 mmol/L dNTPs、0.4μmol/L引物、Taq 2 U。在该体系下,3份蛋黄果种质均能稳定扩增出清晰明亮、数目丰富且稳定性高的条带,说明优化的SCoT-PCR反应体系适用于蛋黄果SCoT分子标记。     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及DNA模板浓度进行优化。结果表明,20μL反应体系中,含Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,模板DNA 30mg/L,引物1.00μmol/L和Taq DNA聚合酶0.4U为最佳反应体系。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

均匀设计优化澳洲坚果SRAP反应体系

以澳洲坚果部分种质为试材,采用U25(55)均匀设计表,对SRAP-PCR反应体系中Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物5个组分的浓度进行优化。结果表明澳洲坚果25μL的SRAP反应体系的最佳组分包括2.5μL10×PCR buffer、1 UTaq DNA聚合酶、40 ng模板DNA、0.2 mmol/LdNTPs、0.2μmol/L引物和3.0 mmol/LMg2+。利用所确立的体系对部分澳洲坚果种质进行扩增的结果清晰可靠,多态性好。     

桦纤孔菌菌丝体基因组DNA的提取及SRAP体系的优化

以野生桦纤孔菌分离得到的菌丝体为材料,采用改良CTAB法对桦纤孔菌基因组DNA进行了提取。从50对引物中筛选出30对扩增产物丰富、具有较高多态性的引物,同时对SRAP反应体系进行了优化。对模板DNA浓度、DNA用量、dNTPs、Buffer、Taq聚合酶、10碱基引物浓度进行优化。结果表明,桦纤孔菌SRAP的最佳体系为:模板DNA浓度为2 mg/L,dNTPs1.0 mmol/L,Buffer1.0 mmol/L,TaqDNA聚合酶0.3 U/μL,10碱基引物浓度为1.0μmol/L,加ddH2O至10μL反应体系。     

小干松SRAP-PCR反应体系的建立

以小干松针叶基因组DNA为模板,采用L16(45)正交实验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Taq酶、Mg2+、dNTPs、模板DNA和引物5个因素在4个水平上进行优化.结果表明:小干松SRAP-PCR 20 μL反应体系最佳组合为:Taq酶0.5U,Mg2+浓度2.5mmol/L,dNTPs浓度0.15 mmol/L,模板DNA含量60 ng,引物0.2μmol/L.使用12对SRAP引物,采用优化后的体系进行SRAP-PCR反应,表明优化的体系很好地满足了小干松基因组DNA进行SRAP的扩增要求.     

番茄SRAP-PCR反应体系建立与优化

利用正交实验设计L16(45)对番茄SRAP-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA)在4个水平上进行优化试验研究。结果表明:各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为:Mg2+dNTPs引物Taq DNA聚合酶模板DNA;建立的番茄SRAP-PCR最佳体系(25μL)为:Mg2+2.5mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、dNTPs0.25mmol/L、引物0.4μmol/L、模板DNA 80ng。     

光核桃ISSR扩增体系的优化

为确保光核桃ISSR反应条件的稳定性,以改良的CTAB法提取光核桃基因组DNA,对模板DNA浓度、MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量、引物浓度等因素进行了优化,确立了光核桃ISSR反应体系。结果表明:最佳反应体系为模板浓度40ng/μL、引物浓度0.4μmol/L、Mg2+的浓度2.5mmol/L、酶浓度0.5U、dNTPs浓度0.5mmol/L,为光核桃这一优质的种质资源的遗传多样性研究奠定了理论基础。     

利用正交设计优化辣椒SRAP反应体系

为快速建立优化的辣椒SRAP反应体系,利用L9(34)正交表,探讨了Mg2+、dNTPs、引物和模板DNA4种主要反应成分的浓度变化对SRAP扩增结果的影响。结果表明:通过正交设计实验可高效建立优化稳定的辣椒SRAP反应体系;用该法建立的辣椒SRAP优化反应体系为:20μL反应体系中含10×PCRBuffer 2.0μL、Mg2+2.5 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L,上下游引物各0.4μmol/L、模板DNA10 ng,TaqDNA聚合酶1 U。     

美国红枫SRAP反应体系优化

以美国红枫基因组DNA为模板,采取L16(45)正交实验设计,对影响扩增反应的5个主要因素进行优化。结果表明:在20μL反应体系中,各因素的最佳配比为Mg2+浓度1.5mmol/L,dNTPs浓度2.5mmol/L,引物浓度1.5μmol/L,模板DNA用量50ng,Taq DNA聚合酶用量0.5U。该体系的建立为SRAP技术在美国红枫分子辅助育种实践中提供了技术基础。     

SRAP在西藏木瓜属种质资源研究中的应用

利用正交设计,首次对西藏木瓜属植物SRAP-PCR反应体系中的引物浓度、Taq酶、dNTPs、模板DNA、Mg2+在4个水平上进行优化,建立了木瓜属植物SRAP-PCR反应的最佳体系:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,引物浓度0.4μmol·L-1,Taq酶1.0U,dNTPs浓度0.3mmol·L-1,模板DNA70ng,Mg2+浓度2.0mmol·L-1。用引物组合M1E7和M3E18检验上述优化体系,结果显示该体系具有较高稳定性。在此基础上,用筛选的28对SRAP引物组合对21份西藏野生木瓜资源总DNA进行SRAP-PCR扩增,共检测出420个位点,其中多态性位点数363个,多态性位点百分率为86.67%。为此,SRAP分子标记可用于木瓜属植物遗传多样性的研究。     

部分柿属植物SRAP-PCR反应体系的优化

SRAP技术是一种多态性和信息量丰富的新的分子标记技术,其技术简便、快速,不需预知序列信息,近年来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建以及比较基因组学研究等方面得到广泛应用。为了建立柿属植物SRAP技术体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、引物浓度等因素进行了优化。确定优化的反应体系为:模板DNA30ng,Buffer1×,Mg2+2.5mmol/mL,dNTPs0.2mmol/L,Taq酶1u,引物0.3μmol/L,反应总体积25μL。该体系在柿属植物6种1类型共29个基因型中获得较好的扩增结果,可望在柿属植物起源和进化研究中应用。     

利用正交设计优化甘蔗SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16（45）对甘蔗SRAP-PCR反应体系的五大因素（Mg2＋、dNTPs、引物、模板DNA、Taq酶）在4个水平上进行优化,得到如下结论：各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次是：Mg^2＋、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA;通过对各因素进行筛选,建立甘蔗SRAP-PCR反应的最佳体系（20μL）为：dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.1μmol/L、Mg^2＋2.5 mmol/L、Taq酶0.25U和模板DNA 60 ng。     

安徽乌菜SRAP技术体系的优化

以合肥黄心乌为试材,利用正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度和模板DNA浓度进行5因素4水平的筛选分析,用me3-em3引物组合进行PCR扩增以确定最佳反应体系。结果表明,安徽乌菜SRAP-PCR最佳反应体系为:10×PCR buffer 1μL,Mg2+ 3.0mmol·L-1,dNTPs 0.2mmol·L-1,引物各0.5mol·L-1,模板DNA 4.0ng·μL-1,Taq聚合酶0.05U·μL-1,总体积为10μL。利用此反应体系对安徽乌菜进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定、可靠,可用于安徽乌菜的遗传分析。     

鸭梨Hc ISSR-PCR反应体系的优化

应用正交设计的方法对影响鸭梨Hc ISSR-PCR反应的4个因素(模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶)进行5个水平的优化试验,以DPS 7.55软件分析。结果表明:鸭梨HcISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:模板DNA 60 ng、引物浓度0.4μmol/L、dNTPs浓度0.1mmol/L、TaqDNA聚合酶2 U。     

甜樱桃SSR体系的建立、优化及应用

为摸索适宜甜樱桃的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化,20μL反应体系中,Mg2+、dNTPs和引物的最适浓度为1.5mmol/L、0.2mmol/L、0.4μmol/L,Taq酶宜加入1U,模板DNA应加入10～40ng;引物的最佳退火温度为56.0～62.8℃。用10对引物及建成的反应体系对10个供试品种扩增,6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,共有29个等位位点,证实该体系稳定可靠。     

核桃SSR反应体系的优化

以清香、香铃、爱米格为试材,利用CTAB法提取基因组DNA,将PCR体系的主要成分设定5个梯度,根据每个成分的变化引起的PCR-SSR的效果差异,探讨了核桃SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物WGA321的适宜退火温度进行优化。最终确定了引物WGA321的最适退火温度为48～52℃,PCR反应体系的最佳条件为:15μL体系中,Mg2+1.0mmol/L,dNTPs浓度0.40mmol/L,TaqE用量为0.5U,DNA模板1.0ng/μL,引物浓度为0.4μmol/L。利用此反应体系对部分核桃品种进行PCR扩增并电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合核桃的亲缘关系分析。     

中国李RAPD的优化反应体系及其在品种鉴定中的应用

以5'-GACCGCTTGT-3'为随机引物,以奉化李(Prunussalicinacv.Fenghuali)为试材,对中国李RAPD反应体系进行了优化研究,结果表明:25μL反应体系中,TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、模板DNA和dNTPs5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:1.0U、2.5mmol/L、20ng、40ng和0.2mmol/L。利用该优化反应体系,用10个随机引物,构建了5个中国李品种的RAPD指纹图谱;并以共有谱带率对这些品种遗传关系进行了分析,5个中国李品种的共有谱带率平均为33.2%,变异幅度为20.1%～44.9%。     

正交设计优化果梅ISSR反应体系

以果梅(PrunusmumeSieb.etZucc.)品种鸳鸯梅为试材,采用改良的CTAB法提取果梅嫩叶DNA,利用正交设计L16(45)探讨Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对果梅ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了果梅的ISSR-PCR优化反应体系,在20μL反应体系中含2μL10×Buffer,2.5mmol·L-1Mg2+,0.2mmol·L-1dNTPs,0.32μmol·L-1引物,20~80ng模板DNA,0.75UTaqDNA聚合酶。在此基础上探讨了引物UBC840的最适退火温度、最佳循环次数及延伸时间,引物UBC840的最适退火温度为50.6℃。应用该优化反应体系,用2个不同引物对19份果梅资源DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化的反应体系具有较高的稳定性。