三角帆蚌的瘟病防治

三角帆蚌的瘟病防治潘炳炎，文仲芳（中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，无锡２１４０８１）三角帆蚌瘟病是由嗜水气单胞菌、嵌砂样病毒所引起，常在夏秋两季蔓延。江、浙一带每年５～６月和９～１０月（水温２１～２６℃）为蚌瘟病流行季节，来势凶猛，死亡率甚高。一...     

三角帆蚌蚌瘟病的防治技术

三角帆蚌蚌瘟病的防治技术潘炳炎，文仲芬（淡水渔业研究中心无锡２１４０８１）三角帆蚌是我国淡水人工育珠中的优良品种，所产珍珠具有光泽好、珠粒圆的特点，但作为育珠用的三角帆蚌，在生产过程中因病害而大批死亡，给育珠生产造成重大损失，特别是三角帆蚌的蚌瘟病，...     

红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST.以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减.DNA文库.利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2 424个含插人片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定.使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释.结果获得了30个与红笛鲷免免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHC I和MHCII),免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10,HSP70和HSP90)等.本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础.     

三角帆蚌蚌瘟病原的初步探讨

探讨了三个水产场三角帆蚌大批死亡的病因。取病料经匀浆、离心后取上清液,再经青霉素、链霉素处理或微孔滤膜过滤除菌,人工感染健康三角帆蚌均能引起发病死亡,并能连续传代。其症状和病理解剖变化与自然发病的蚌相似。病原病毒粒子有囊膜,核衣壳呈二十面体对称,大小80～120nm,暂称为蚌的类疱疹病毒。含毒病料置50％甘油磷酸盐缓冲液中,在0～4℃冰箱保存6个月,-20℃低温冰箱中保存一年半,仍有致病力。     

三角帆蚌瘟病的组织病理研究

对健康及患瘟病三角帆蚌的１３种脏器组织作了系统的形态结构观察和组织化学分析，结果表明，三角帆蚌瘟病的组织病理变化主要集中在病蚌的肝脏、胃和直肠等组织。病毒侵袭蚌体后，肝脏的吸收细胞、未成熟细胞以及胃、直肠的纤毛上皮细胞内出现病毒包涵体，ＤＮＡ和ＲＮＡ等正常代谢受到抑制，ＡＫＰ和ＡＣＰ酶的活性和分布发生异常，细胞内消化作用受阻，最后病变细胞解体，导致肝脏、胃和直肠等的广泛受损。病蚌因消化系统坏死和消     

三角帆蚌瘟病的防治

我省珍珠业的发展始于六十年代末。育珠蚌有三角帆蚌、褶纹冠蚌、背角无齿蚌等，其中尤以三角帆蚌以育成的珍珠质量最佳，价值最高。但自七十年代中期，江南一带出现大面积三角帆蚌死亡现象。当初，我省有些地区从外省购进不少三角帆蚌，导致我省1983年发生三角帆蚌暴发性的死亡，一直延续至今，群众称之为三角帆蚌瘟病，     

三角帆蚌蚌瘟病的研究现状

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)为中国特有种。在河北、山东、安徽、湖南、湖北、江苏、浙江、江西等省均有分布,主要集中在长江中下游的湖泊及其周围的水域。贝壳大而扁平、背后缘向上扩展形成一大三角帆形翼,外行呈三角形。三角帆蚌的分类地位属于软体动物门(Mollusca)双壳纲(Bivalvia)古异齿亚纲(Palaeoheterodonta)蚌总科(Unionacea)蚌目(Unionidae)珠蚌科(Unionidae)帆蚌属(Hyriopsis)三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)。     

三角帆蚌瘟病的病原鉴定

三角帆蚌近几年连续发生大面积死亡,群众称之谓三角帆蚌瘟病。对49个疫点的调查与实验观察表明,不同地区的三角帆蚌大批死亡具有相同的基本特征:本病发生在夏秋两季,只侵害2令以上的三角帆蚌,当年死亡率可达80％左右。本病病程较长,并与环境温度呈密切的负相关:y=52.8653-1.5830x,γ=-0.7693,P<0.01。发病蚌的排水与进水孔纤毛收缩,排粪减少,晚期无粪,张壳死亡。野外与实验室内均能自然感染健康帆蚌。氯霉素、四环素等多种药物在野外与实验室治疗均无效果。自然发病蚌以及相应除菌材料人工感染的发病蚌,病变部位与病变性质相互一致:消化腺与多种上皮细胞水泡变性,消化腺细胞浆出现缎密的酸性包含物,内质网普遍地高度扩张,这符合于一般动物病毒病的组织病理特征。     

三角帆蚌钙网蛋白基因cDNA的分子特征与表达分析

为研究淡水珍珠形成相关基因及调控机理,以三角帆蚌为研究对象,借助cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了三角帆蚌的钙网蛋白基因(calreticulin,HcCRT) cDNA序列,该序列长1 437 bp,包含231 bp的5'非编码区(untranslated region,UTR)和615 bp 3'UTR以及591bp的开放阅读框(ORF),共编码196个氨基酸残基,包含一段由21个氨基酸组成的信号肽和一段由175个氨基酸的成熟肽,分子量约为22.4 ku,理论等电点5.01.氨基酸序列分析表明,该序列不存在跨膜结构,疏水性分析显示该蛋白整体为亲水性蛋白.氨基酸列比对分析显示,HcCRT具有保守的钙网蛋白家族结构,具有2个保守的钙网蛋白家族标签序列:KHEQNIDCGGGYLKVF和IMFGPDICG,与其他已知物种的CRT具有较高保守性,其中与斑马鱼的相似度为77％,与长牡蛎和马氏珠母贝的相似度为70％.对三角帆蚌HcCRT蛋白序列的二级结构和三级结构进行预测分析,显示该蛋白同时含螺旋和折叠.实时荧光定量PCR分析结果显示,HcCRT在外套膜、血液、鳃、斧足、肝脏、肾脏、肠和闭壳肌等8个组织中均有表达,其中在外套膜中表达量最高,血液次之,在其他组织的表达量极少.初步推测HcCRT参与了三角帆蚌珍珠形成的生物矿化过程.     

黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析

应用抑制性差减杂交技术构建了黄鳝(Monopterus albus)Ⅳ期卵巢和间期性腺的差减cDNA文库.正向差减杂交以间期性腺为试验方,Ⅳ期卵巢为驱动方;反向差减杂交以Ⅳ期卵巢为试验方,间期性腺为驱动方.将获得的差减cDNA片段连接质粒载体,然后转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含461、678个重组子.经PCR扩增鉴定插入片段范嗣为200～2000 bp.随机选取正、反文库共100个阳性克隆测序分析,得到90个有效基因片段,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对.进一步从文库中选取2个基因用于半定量RT-PCR,对文库质量进行验证.结果表明,所建文库能够达到富集这两期性腺差异表达基因的目的.黄鳝性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础.     

三角帆蚌稚蚌形态发育与生长特性

在人工繁育现场,水温为26.5～32.0 ℃的条件下,对三角帆蚌钩介幼虫寄生期结束至发育到呈三角形的稚蚌阶段的形态变化过程进行了连续观察。结果发现三角帆蚌稚蚌形态发育过程根据其变化特点可分为4个阶段。刚脱落的稚蚌平均壳长221.88 μm,此时帆没有形成,全高等于壳高;前4 d里稚蚌增厚显著,为贝壳增厚期。5 d后到第23天,壳顶开始突起,为壳顶突出期;此期出现了一个显著的变化,到15 d时,壳顶后端生长速度超过了前端。23 d后到第34 天,翼开始出现,为两翼形成期。34 d后到第60 天,帆开始形成,为帆生长期;此期全高和壳高的比例加大,壳顶不再是稚蚌的最高点。从第60天开始,外型与成体相似,稚蚌发育阶段完成。三角帆蚌稚蚌发育过程中最明显的变化是壳顶位置的变化。对三角帆蚌稚蚌生长特性的研究表明：壳长与日龄的关系式为L=329.39e^0.059t（r=0.968）,全高与壳长的关系式为H=0.776L-103.36（r=0.997）。     

三角帆蚌HcTyr基因内壳色性状相关SNP筛选及图谱定位

为研究三角帆蚌HcTyr基因与内壳色性状的相关性,本实验根据已分离的三角帆蚌HcTyr基因进行引物设计和片段扩增,并用144只三角帆蚌对其多态性进行筛选和验证,卡方检验分析了SNP位点和三角帆蚌内壳色相关性,并对HcTyr基因进行了图谱定位。结果显示,在HcTyr基因上筛选出8个SNP位点,其中有7个SNP位点与三角帆蚌内壳色L、a及d E呈显著相关性,用这7个SNP位点做单倍型构建和分析,发现Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ这3种单倍型在白色群体中出现的频率极显著高于在紫色群体中出现的频率,而Ⅴ和Ⅶ这2两种单倍型在紫色群体中出现的频率极显著高于白色群体。进一步在商业养殖群体中验证发现,Ⅳ和Ⅶ这2种单倍型可分别作为白色和紫色群体的优势单倍型。研究表明,三角帆蚌HcTyr基因可作为内壳色相关的候选基因,其部分SNP位点可用于三角帆蚌分子辅助育种。另外本实验还将HcTyr基因定位在三角帆蚌LG16连锁群上,这为进一步解析该基因调控珍珠颜色形成的分子机制奠定了基础。     

三角帆蚌活化蛋白激酶C受体1基因(HcRACK1)的克隆及表达分析

为了探究RACK1基因在三角帆蚌免疫系统中的调控机制,采用RACE技术克隆得到三角帆蚌RACK1基因(命名为HcRACK1)的c DNA全序列,并对该序列进行分析。结果显示,HcRACK1基因全长为1249 bp,其中开放阅读框957 bp,编码318个氨基酸。蛋白质结构域分析显示HcRACK1含有RACK1家族特有的7个WD40结构域。运用荧光定量PCR技术分析HcRACK1在正常组织中及受到嗜水气单胞菌侵染和重金属镉暴露后相关组织表达量的变化。结果显示,HcRACK1在各个组织中均有表达,其中闭壳肌中表达量最高;嗜水气单胞菌侵染后,HcRACK1在血淋巴中的表达量逐渐上升,24 h时达到峰值,随后下降;暴露在100μg/L浓度的重金属镉中,HcRACK1在肝胰腺中的表达量逐渐上升,在第3天达到峰值;血淋巴在第2天达到峰值,随后下降;鳃中HcRACK1的表达量无明显变化。上述结果表明,Hc RACK1与细菌及镉引起的机体的氧化应激反应有关,并能参与到机体的免疫反应中。     

三角帆蚌CAT基因cDNA全长克隆及表达分析

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)首次克隆了三角帆蚌过氧化氢酶(CAT)基因的cDNA全长序列,为2 804 bp,包含112 bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),1 303 bp的3′UTR和1 388 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)。ORF区共编码462个氨基酸,推算的分子量约为52.7 ku,理论等电点为6.35。多序列比对结果显示,有一段CAT氨基酸高度保守的催化位点序列FDRERIPERVVHAKGAG。三角帆蚌CAT基因有12个与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合的氨基酸残基,分别是Asp107、His153、Phe157、Ser160、Arg162、Asn172、Try174、Lys196、Val261、Trp262、His264和Try317,其中第261位和第264位的氨基酸在不同物种间有所区别。比对结果得到的三角帆蚌CAT基因的氨基酸序列,与软体动物的CAT基因相似性高达99%,与虾类、鱼类、两栖类、哺乳类的CAT基因相似性也达到98%~99%,可推断属于CAT3。利用CAT基因推断得到的氨基酸序列构建NJ系统树,分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,再与虾类聚在一起,然后依次与鱼类、两栖类和哺乳类聚在一起。荧光定量结果显示,CAT基因在三角帆蚌的7个组织均有表达,其中在肾中的表达量极低,在血液中表达呈上调趋势且明显区别于其他组织,在另外5个组织中总体上呈现不统一的先上调后下调的趋势。     

三角帆蚌新发现的贝壳基质蛋白基因hic9的分离、鉴定及其在珍珠早期形成过程中的作用

为进一步研究珍珠质形成的分子机理,使用RACE-PCR技术从三角帆蚌外套膜中克隆到一个新的贝壳基质蛋白基因hic9。RT-PCR和原位杂交技术结果显示,hic9主要在闭壳肌和外套膜中表达,且在外套膜外褶的外表皮各部分都有信号,在壳皮沟中同样有信号,这些结果表明,hic9是一个同时参与了贝壳角质层、棱柱层和珍珠层形成的多功能基质蛋白基因。hic9富含甘氨酸(14.81%)、脯氨酸(13.58%)和丙氨酸(12.35%),在序列中部形成"Gly-X-X"的结构(X为任意氨基酸),与近C末端连续重复丙氨酸结构(polyA)一起使hic9具有类似蛛丝蛋白的结构特征。hic9 C末端由一段疏水性序列"LAWMLFV"组成,推测这段序列形成β折叠结构,紧邻该序列89～91位是"Asp-Leu-Asp"序列,这是一个典型的Ca2+结合位点。此外,通过实时定量PCR检测了珍珠形成早期阶段hic9在初生珍珠囊中的表达情况,插片后3～15 d hic9在珍珠囊中的表达水平维持在大致相同的表达水平,在碳酸钙沉积物从无序向有序转变时期(18～25 d),表达水平较第15天有显著的升高,这表明hic9参与了这一过程,在珍珠层的形成过程中发挥了关键作用。     

三角帆蚌类丝状基质蛋白基因silkmaxin的克隆及其在贝壳和珍珠生物矿化中的作用

贝壳基质蛋白指导了珍珠形成过程中碳酸钙的成核、晶体生长和晶型选择等关键过程。为进一步研究珍珠形成的分子机理,本实验使用RACE-PCR技术克隆得到一个新的贝壳基质蛋白基因,并命名为silkmaxin。组织表达分析和原位杂交分析表明,该蛋白于外套膜缘膜部外上表皮组织特异性表达,证明silkmaxin基因所编码的蛋白属于珍珠层基质蛋白。silkmaxin基质蛋白氨基酸序列富含甘氨酸(Gly,33.0%)和丝氨酸(Ser,10.4%),蛋白结构由β-折叠构成,类似丝状蛋白结构。分析珍珠形成早期珍珠囊中该蛋白基因的表达发现,silkmaxin基因在珍珠囊内碳酸钙沉积物从无序到有序的转变过程中起了重要作用。通过RNA干扰实验可知,贝壳基质蛋白是珍珠层文石小片正常生长不可缺少的因子,当silkmaxin基因表达被抑制,文石小片的成核、大小和形状均发生了改变。     

三角帆蚌早期阶段生长性状遗传参数估计

利用巢式设计构建了三角帆蚌17个父系半同胞家系,包括51个全同胞家系。幼蚌规格达到1 cm时,在每个全同胞家系随机取40个个体,共2 040个个体,测量它们的壳长、壳高、壳厚、体质量4个生长性状,并对测量数据进行了遗传分析。结果表明,壳长、壳高、壳厚、体质量这4个性状的遗传力分别为:0.356±0.047,0.488±0.060,0.453±0.055,0.518±0.050。这4个性状的表型相关和遗传相关的范围为:0.476~0.709和0.574~0.868。三角帆蚌早期阶段生长性状有足够的遗传方差,可以对它们进行遗传改良,预期能够获得较好的遗传进展。这4个性状之间的表型相关和遗传相关均较紧密,可以通过对体质量进行选择,同时改良其它性状。