碱性土壤基因组DNA的分离纯化和基因文库的构建

直接从广西南宁市凤凰纸业排污沟碱性土壤样品中抽提和分离纯化混合基因组DNA，所获得DNA的产量为每克土壤样品10～30pg。采用限制性内切酶EcoR1酶处理后，构建了以pGEM-3Zf( )为载体的DNA部分文库。文库的容量为23650个转化子。外源片段DNA平均大小为3．2kb。建库效率为每克环境样品获得6000个左右的含1～15kb外源随机插入片段的克隆。通过DNA序列测定和同源性比较，对从文库随机词取的16个转化子序列进行分析，发现13个外源插入片段包含序列尚未确定的DNA片段。     

江西典型红壤区土壤细菌基因组文库构建及功能初步分析

地球上的微生物,仅原核生物细胞总数就大约在4×1030～6×1030,包含的独立基因型在106～108种之间[1].因此,微生物所具备的分类、功能、遗传和系统发育等多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供资源方面起着重要的作用[2].然而长期以来由于受到研究方法和手段的限制,土壤中绝大多数微生物的功能还不清楚.环境样品的宏基因组学(metagenomics)是对环境样品中微生物群体基因组进行的分析,该方法在众多用于获得未培养微生物的生理和遗传特性的方法中,逐渐显示出强大的优势[3,4].国外已有从不同环境样品的宏基因文库中,通过功能性筛选获得新的抗生素、脂肪酶、丁质酶、膜蛋白、4-羟基丁酸脱氢酶等合成基因或相关基因,以及对群落结构组成和功能进行分析的报道[5～9].国内也逐步开始有相关研究[10,11].     

以质粒载体构建土壤宏基因组文库的研究

从土壤中提取土壤总DNA,切割成一定长度的DNA片段并连接到载体上,然后转化宿主菌,形成一个重组DNA文库即宏基因组（metagenome）文库.目前对宏基因组的研究在国际上是土壤微生物学研究的前沿领域和热点.文库构建后可以根据宿主细菌获得的功能筛选相应的克隆;也可以用已知的探针分离目的基因片段,加上表达调控元件后获取活性产物,所以通过宏基因组文库可以规避微生物培养的限制而寻找新的功能基因或者直接筛选活性物质;在早期宏基因组还被用来研究土壤微生物的遗传多样性.因此构建宏基因组文库是研究微生物分子生态学和开发微生物资源的强有力工具.本研究从土壤中直接分离DNA,部分酶切后分别回收2～6kb和6～9kb片段,然后分别与pUC19质粒载体连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α构建了土壤宏基因组文库,实验中比较了不同DNA片段长度和不同的转化方法对文库构建的影响.     

蔺草基因组DNA提取方法的比较研究

以16个蔺草品种实生苗和4个蔺草品种组培苗为材料,探讨了CTAB改良法与DNA试剂盒法对蔺草基因组DNA提取质量的影响。结果发现,对于同一品种而言,CTAB改良法提取获得的DNA A260nm和OD值远低于试剂盒提取法,前者的DNA浓度仅为0.65~4.90μg/ml,而后者则为5.10~32.80μg/ml,后者为前者的1.6~21.2倍。这表明试剂盒提取法更适合于蔺草基因组DNA的提取。试验还发现提取材料对基因组DNA的质量有显著影响,蔺草组培苗优于实生苗。     

一种土壤微生物总DNA的高效提取方法

获得高浓度、大片段、多样性程度高的土壤微生物总DNA 是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。本文采用间接法(菌体细胞回收法)提取红壤地区两种土壤类型的土壤微生物总DNA,定量计算其回收率,并与直接法(细胞原位裂解法)比较了提取效率和纯度。结果表明:红壤地区2种土壤每克干土的总DNA提取量,间接法约为0.34和0.53礸/g干土,直接法约为13.62和24.32礸/g干土;间接法的提取效率低于直接法,但所得DNA片段较大,且Sau 3AⅠ 酶切和16 S rDNA通用引物PCR扩增结果显示,间接法比直接法更能有效地去除土壤中的某些抑制剂,所得总DNA的纯度更高,有利于后续操作。     

黄瓜白粉菌基因组DNA 提取方法比较

以黄瓜白粉病菌为试验材料,比较分析了改良CTAB法、SDS法和真菌试剂盒法对黄瓜白粉病菌基因组DNA提取的效果。结果表明,CTAB法提取的黄瓜白粉菌基因组DNA在纯度(R=A260 nm /A 280 nm)和产量上均优于SDS法和真菌试剂盒法,且杂质少。CTAB法提取的黄瓜白粉菌基因组DNA产率为204.3 μg/g,而SDS法和真菌试剂盒法分别为147.7、117.7 μg/g,且方法产率之间差异极显著。采用CTAB法提取的DNA纯度较高,为1.969 6;SDS法和真菌试剂盒法提取的DND纯度较低,分别为1.832 2和1.507 9。     

组培枣苗基因组DNA提取方法及其含量的比较

本文以组培二倍体木枣、四倍体变异苗和二倍体京枣苗为供试材料,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测技术,研究了不同提取方法对其叶片基因组DNA的提取效果。结果表明,CTAB法提取枣叶片DNA的效果优于SDS法,表现为蛋白质杂质干扰少,DNA结构完整、纯度与得率高;用不同方法提取的样液中DNA片段的大小和分布是不同的,以改进的CTAB法提取的样液中大片段的DNA分子较多,所以在其底部分布较多,而用SDS法提取的样液中小片段的DNA分子较多,故在其上部分布较多;电泳时不同的加样量获得的DNA带也有较大差异,试验选出CTAB法提取样液的适宜的加样量为5μL（7.485μg）,SDS法提取样液的适宜的加样量为4μL（5.988μg）;枣品种间DNA的含量明显不同,木枣四倍体的DNA含量（3.074μg/μL）相当于组培木枣二倍体（1.497μg/μL）的2倍,也明显地高于京枣二倍体（2.182μg/μL）。这些结果为枣树遗传种质资源的研究奠定了一定的科学与技术基础。     

苹果基因组DNA的快速提取

提出了一种适用于苹果（Malus pumila Mill)RAPD分析的基因组DNA的快速提取方法。用本法提取的DNA质量高，简便，快速，经济，每天可提取200个DNA样品，每个DNA样品可供50－100次PCR反应，用10个碱基随机引物进行PCR扩增，95％以上的样品都才扩增出3－10条清晰的泳带。     

西北地区耕地土壤真菌DNA提取方法比较

由于西北土壤理化性质的复杂性和真菌特殊性,所以从土壤中提取真菌基因组DNA就相对细菌更困难。在2种常用的土壤微生物基因组DNA提取方法与在传统提取方法的基础上,结合了一种专门适用于真菌的提取方法进行了比较,并且利用真菌28SrDNA通用引物U1/U2进行扩增。三种提取方法比较结果表明:SDS法提取的DNA纯度最低,传统CTAB-SDS的DNA产量最低,实验室的提取方法既可以提高DNA产量又可以保证DNA的片段完整性,并且本实验室的提取方法扩增效果最好,可广泛应用于西北地区土壤真菌的分子生物学研究。     

土壤微生物总DNA提取方法的比较

采用4种土壤DNA提取方法提取了5种类型土壤的微生物总DNA，并对4种提取方法的DNA提取效果进行综合分析，进一步通过PCR—DGGE扩增提取DNA中的细菌16S rDNA片段，并对扩增产物进行DGGE电泳分析。结果表明，SDS-高盐缓冲液法抽提的DNA得率最高，SDS-酚氯仿抽提法的DNA得率最低。DNA的纯度，以BIO-101 DNA Extraction Kit试剂盒法最高，改进试剂盒法纯度最低。通过PCR-DGGE分析土壤微生物多样性结果表明，BIO-101 DNA Extraction Kit试剂盒法提取的DNA代表的微生物多样性最全，而SDS酚氯仿法抽提的DNA代表性最差。     

猪粪和土壤样品中微生物DNA提取方法的比较

猪粪施于土壤可能会对土壤微生物多样性造成影响，为选用同一种DNA提取方法用于土壤和猪粪微生物DNA的提取，该文采用了化学裂解法和试剂盒法同时从土壤和猪粪样品中提取微生物DNA，并对这两种方法的提取DNA的效果进行了比较。结果表明，试剂盒法不能用于提取土壤中的微生物DNA；可以从猪粪中提取到DNA，PCR扩增能得到目的产物，但重复性不高。化学裂解法提取的土壤微生物DNA浓度高但纯度低，纯化后纯度增加，但DNA有所损失，用于PCR扩增时结果不理想；处理猪粪样品，提取的DNA浓度较低但纯度较高，PCR扩增结果比较理想。由此可见，化学裂解法用来提取猪粪样品中的微生物DNA是可行的，但需寻求更好的土壤样品微生物DNA的提取方法。     

猪粪和土壤样品中微生物DNA提取方法的比较

猪粪施于土壤可能会对土壤微生物多样性造成影响,为选用同一种DNA提取方法用于土壤和猪粪微生物DNA的提取,该文采用了化学裂解法和试剂盒法同时从土壤和猪粪样品中提取微生物DNA,并对这两种方法的提取DNA的效果进行了比较。结果表明,试剂盒法不能用于提取土壤中的微生物DNA;可以从猪粪中提取到DNA,PCR扩增能得到目的产物,但重复性不高。化学裂解法提取的土壤微生物DNA浓度高但纯度低,纯化后纯度增加,但DNA有所损失,用于PCR扩增时结果不理想;处理猪粪样品,提取的DNA浓度较低但纯度较高,PCR扩增结果比较理想。由此可见,化学裂解法用来提取猪粪样品中的微生物DNA是可行的,但需寻求更好的土壤样品微生物DNA的提取方法。     

Pre-lysis washing improves DNA extraction from a forest soil

A pre-lysis buffer washing procedure was introduced to DNA extraction from a forest soil with high organic matter and iron oxide contents. Sodium phosphate of 0.1 M (pH 7.5) was used as a buffer to wash soil samples when subsequent lysis buffer was phosphate, and 20 mM EDTA (pH 7.5) was used when subsequent lysis buffer included EDTA. Initial experiments were not successful because the DNA extracts could not be amplified by polymerase chain reaction (PCR). The consideration of introducing a pre-lysis washing procedure was based on the idea that the washing should promote soil dispersion and homogeneity, decrease DNA adsorption by soil components (e.g. iron oxides), and remove covalent cations and those easily-dissolving organic compounds from the soil samples. Results revealed that humic substance content decreased by 31%, but DNA yield increased by 24% in the DNA extracts of the pre-lysis washing procedures, compared to the non-washing procedures. DNA extracted by the pre-washing procedure needed less purification for subsequent 18S and 16S rDNA PCR amplifications. It was recommended that the pre-lysis buffer washing should be used for DNA extraction from those difficult environmental samples, such as the forest soil with high contents of organic matter and iron oxides.     

丹参糖蛋白的提取精制及其理化性质研究

采用单因子试验和L9(34)正交试验设计,研究料液比、提取时间、提取温度和NaCl浓度对丹参糖蛋白提取率的影响。结果表明,提取物是糖含量为26.24%、蛋白质含量为37.34%的通过O-糖肽键连接的酸性糖蛋白;最佳提取工艺条件:料液比1∶20,提取温度70°C,提取时间4 h,0.1 mol/L的NaCl;Sevage法脱蛋白7次,80%乙醇醇析,可得精制糖蛋白5.03%。     

微波辅助萃取-大孔树脂分离纯化芳樟叶黄酮

为了综合利用芳樟叶精油提取过程中产生的大量残渣,该文利用微波辅助萃取和大孔树脂选择性吸附来分离纯化芳樟叶黄酮。采用L9(34)正交试验,考察了萃取剂、微波辐射功率、辐射时间及料液比对黄酮得率的影响,确定了微波辅助萃取的优化工艺条件:以60%乙醇做萃取剂,微波功率320W,间歇辐射2次,每次1min,料液质量体积比1:12,在此条件下,芳樟叶黄酮的提取得率为2.97%,与乙醇热回流提取方法相比,得率提高了6.83%,时间缩短了98.89%;为进一步纯化萃取所得的黄酮提取物,选择6种大孔吸附树脂,测定芳樟叶黄酮在树脂上的吸附量和解吸率,筛选出了吸附剂HPD-450,其对芳樟叶黄酮有较好的静态吸附和解吸效果。经装填有大孔树脂HPD-450的固定床纯化后黄酮纯度由22.49%提高到51.28%,纯化倍数2.3倍。     

光皮木瓜齐墩果酸超声波辅助提取及纯化工艺

以光皮木瓜为原料,利用超声波辅助提取及大孔吸附树脂纯化齐墩果酸。通过二次正交旋转组合设计优化提取工艺条件,采用静态吸附和解吸试验筛选合适的大孔树脂,并运用动态吸附和解吸试验验优化纯化条件。结果表明,超声波辅助提取最佳工艺条件为:超声功率600 W、提取温度53℃、液料比8:1、超声波提取70 min,回流提取120 min,齐墩果酸得率为3.000 mg/g;XDA-1型大孔树脂对齐墩果酸具有较好的吸附和解吸效果,最佳纯化工艺条件为上柱液浓度0.794 mg/mL,吸附流速0.5 mL/min;以90%浓度乙醇洗脱,洗脱流速1.0 mL/min,纯化后得提取物中齐墩果酸纯度可达26.55%。     

菜籽蛋白的提取和纯化

为了对菜籽饼进行综合利用,以低温压榨制油的双低菜籽饼为原料,探讨了菜籽蛋白的提取和纯化工艺.通过料液pH值的先后调节对比、正交、提取次数和纯化试验,得到较佳工艺条件:采用先调pH值法,水溶液的pH值为12,提取时间为20 min,温度为室温,提取3次,通过pH5和7的两步沉淀,经干燥得到分离蛋白,蛋白纯度达84.8%,得率为38.9%,且有害物质残留较少.先调pH值法与后调法相比,总的提取率可提高20个百分点,达90%以上.     

Simple method of genomic DNA extraction from Rhizobia in dried nodules of Phaseolus vulgaris for strain differentiation by PCR-based DNA fingerprinting

Repetitive DNA peR fingerprinting of bacterial genomic DNA is a useful tool for typing and differentiation of rhizobial strains. The method was reported to be suitable for strain differentiation of Rhizobia present in individual root nodules of some leguminous plants without the need for isolation and cultivation of the strains, in which rhizobial genomic DNA was extracted directly from each fresh or frozen nodule. We developed a new protocol of rhizobial genomic DNA extraction/purification from dried nodules of Phaseolus vulgaris for generating repetitive DNA peR fingerprints of Rhizobia present in the nodules. The simplified protocol consists of only three major steps, heat extraction of genomic DNA from rhizobial cells prepared from dried nodules, ethanol precipitation of the DNA and Sephadex G-50 column purification of the DNA, and generated fingerprints with good quality for differentiation of Rhizobia strains. The protocol will be useful to examine the nodule occupancy of inoculated rhizobial strains in field experiments.     

裙带菜中褐藻糖胶的提取纯化及其组成的研究

该实验优化了裙带菜褐藻糖胶的提取工艺,对粗多糖进行了分离纯化,并研究了各组分的单糖组成和硫酸根含量。利用响应面优化法,依据二次回归分析确定裙带菜褐藻糖胶的最佳提取工艺为：提取温度76℃,提取时间2.5 h,料液比1︰6.5。在此条件下提取2次,粗多糖的提取率可达到7.53%。提取的粗多糖用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化,共得到5个峰,干燥后得到5个组分。用硫酸钡比浊法测定5个组分的硫酸根含量分别为8.3%、19.2%、30.1%、38.4%和33.0%。糖腈乙酸酯衍生物气相色谱测得各组分的单糖组成分别为：组分1主要含有甘露糖和半乳糖;组分2主要含有鼠李糖,岩藻糖,木糖,甘露糖,葡萄糖和半乳糖;组分3主要含有鼠李糖,岩藻糖和甘露糖;组分4主要含有岩藻糖和半乳糖;组分5主要含有岩藻糖,甘露糖和半乳糖。