马立克氏病病毒致弱毒株的致病性及致瘤相关基因序列分析

为培育及鉴定马立克氏病病毒(MDV)致弱病毒株,本研究将4株现地流行MDV强毒株(L-ZY、L-CZ、L-MS和L-SY株),在体外经CEF连续传代至110代,获得相应的4株高代次病毒株(L-ZYp 110C、L-CZp110C、L-MSp110C和L-SYp110C株).其中的L-MSp110C和L-SYp110C株对SPF鸡的致病性试验结果显示:以2×103 pfu和2×104 pfu的剂量接种1日龄SPF鸡,在试验期(12周)内试验鸡均没有引起马立克氏病病变;高代次病毒株在体外增殖能力增强,而在体内增殖能力显著低于亲本病毒株.与亲本病毒株基因序列比对发现:4株高代次病毒株病毒基因组中Meq和RLORF 12基因均有不同程度的缺失和插入;132 bpr序列拷贝数均显著增加;其中3株病毒株的RLORF4基因存在大片段缺失.以上结果表明,MDV强毒株体外传代至110代后,病毒增殖能力和主要致瘤相关基因的遗传特性均发生了改变,致弱毒株的毒力已完全弱化.该研究为进一步筛选MD弱毒疫苗提供了实验依据.     

鸡马立克氏病病毒感染对鸡神经系统损伤的研究

为研究不同毒力的鸡马立克氏病毒(MDV)在鸡神经系统中的感染规律及其对神经系统的损伤进程,本研究选用不同毒力的血清1型MDV (MDV-1)病毒株感染4日龄的SPF鸡,在接毒后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d、25 d、28 d和35 d动态检测病毒载量的变化,并对感染后5 d和21 d的不同病毒株感染鸡的脑部和坐骨神经进行组织病理学观察。结果显示,MDV-1强毒株在SPF鸡脑部的复制能力显著高于弱毒株(p<0.05);特超强病毒株BS在脑组织中出现的时间最早,早期复制最快。但不同毒力的MDV-1株在坐骨神经处的复制能力与其毒力无直接的关系。组织病理学观察显示,在感染早期MDV-1强毒株对SPF鸡脑组织的损伤强于弱毒株;在感染后21 d,强毒株和弱毒株造成的脑部损伤存在明显的不同;而在坐骨神经处,强毒株造成的损伤明显强于弱毒株。本研究揭示了不同MDV病毒株在SPF鸡脑和坐骨神经的复制动力学特征和组织病理学特征,为MDV-1在宿主神经系统中的感染、增殖及造成的损伤提供了实验依据。     

鸡马立克氏病病毒在鸡淋巴细胞和羽髓中的复制动力学分析

马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒血清1型（MDV1）引起的鸡高度接触性淋巴细胞增生性疾病,MDV1在体内的复制状况与其致病性强弱及传播能力直接相关。本实验选择近几年从国内不同地区MD暴发鸡场分离的6株MDV1强毒株、弱毒疫苗“814”株和国内标准MDV1强毒J-1株,分别人工感染SPF鸡,采用双重实时荧光定量PCR（FQ—PCR）方法,检测感染后1d～28d病毒在淋巴细胞和羽髓中的复制状况。结果显示,接种1d后即可在淋巴细胞中检测到MDV1（10^2.6 copies～10^5.2 copies／10^6 cells）;在检测期间,淋巴细胞中病毒载量略有上升的趋势,总体呈现不规律变化,而且变化并不明显。接种7d后羽髓中病毒载量开始显著增加,14d～21d达到峰值,超强毒株峰值处病毒载量可达到10^7 copies／10^6 cells,峰值期病毒载量是感染前期（1d～7d）的100～10000倍。强毒株在体内的病毒载量高于弱毒株,即复制能力高于弱毒株。研究表明,MDV1国内流行的毒株有增殖速度快,病毒载量高的新特点;MDV1致病性的高低与在其在体内的复制能力的高低呈正相关。     

MDV Meq基因簇miRNAs基因缺失株的致病性

为了探讨Meq基因簇microRNAs(Meq-clustered miRNAs)对马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)致病性的影响,本研究将MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失株GX0101ΔMeq-miRNAs感染1日龄SPF鸡,并于感染后90d内进行毒株致死率、致肿瘤率、鸡体质量、免疫器官指数和鸡血液中病毒含量等方面的检测。结果显示:1日龄SPF鸡在接种GX0101ΔMeq-miRNAs后90d内累计死亡率和眼观肿瘤发生率分别为4%和8%,与亲本株GX0101BAC相比分别下降了23.5倍和2.5倍;与鸡胚成纤维细胞(chicken fibroblast cells,CEF)阴性对照相比,GX0101△Meq-miRNAs感染鸡在整个试验期间体质量差异均不显著(P0.05);在感染后14~21d,GX0101△Meq-miRNAs组的法氏囊指数和胸腺指数均显著降低(P0.05);与亲本株相比,GX0101△Meq-miRNAs在血液中的含量及导致的显微肿瘤发生率均下降。结果表明:MDV Meq-clustered miRNAs基因的缺失降低了MDV的致病性,Meq-clustered miRNAs具有调控MDV致病性的功能。     

鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LHLJ/04V的分离鉴定及致弱的初步研究

从黑龙江省某鸡场发病鸡群的肾脏中分离到一株病毒,通过病毒致SPF鸡胚病变特征、对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征以及RT-PCR鉴定等方面的研究,表明该病毒为鸡传染性支气管炎病毒,并命名为CK/CH/LHLJ/04V。通过对该病毒基因型分析以及对SPF鸡致病性试验发现该病毒为我国近年来流行的一类重要IBV的代表。将该毒株在SPF鸡胚连续传代110代(P110),取不同代次毒进行动物实验。结果显示,该毒株对SPF雏鸡的致病力随鸡胚传代次数的增加而逐渐降低。P110代毒以105.0 EID50/0.1 mL的剂量通过点眼滴鼻接种15日龄SPF雏鸡,鸡群发病率和死亡率均为0。不同代次毒接种SPF鸡对同源毒株P3代强毒的攻击均具有100%保护性。实验表明,IBV毒株CK/CH/LHLJ/04V P110对SPF雏鸡已无致病性,但仍具有良好的免疫原性,可作为研制IB弱毒疫苗的候选毒株。     

MDV Z_4和HVT Fc_(126)在不同遗传抵抗力的CEF上的生长特性及研究

马立克氏病(MD)疫苗 Z_4和 HVT Fe-126病毒在对MD 病毒(MDV)有高度易感性的 P 系鸡、有高度抵抗力的 O 系鸡和普通非免疫鸡的鸡胚成纤维细胞(CEF)上形成的病毒蚀斑大小和数量均无显著差异.说明,CEF 对MDV 的易感性不受遗传因素的影响.MDV 血清2型 Z_4毒株和血清3型 HVT Fc_(126)株在 CEF 上的生长特性比较表明,Z_4毒株生长速度慢,蚀斑小,培养10天蚀斑大小为0.23mm~2,相当于 Fc_(126)毒株培养第4天时的水平.     

4株H9N2亚型禽流感病毒分离株对SPF鸡致病性研究

对2013~2015年,从各省养鸡场分离的4株H9N2亚型禽流感病毒进行致病性试验,结果显示,4株H9N2亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡后,所有鸡均发生感染并排毒,感染鸡泄殖腔排毒量明显高于口腔,致病性强的毒株比致病性弱的毒株排毒时间要长,在接种后的3~5 d个别鸡表现出精神沉郁,缩头闭眼的情况,并且整体出现食欲下降,但并没有鸡死亡;4株H9N2亚型禽流感病毒感染SPF鸡后,在鸡脏器中的分布各不相同,致病性强的毒株比致病性弱的毒株更具有较广的组织嗜性,在鸡体内各个组织器官复制能力更强。结果表明,4株H9N2亚型禽流感病毒对SPF鸡均具有一定的致病性。     

鸡马立克氏病的流行与免疫

鸡马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒引起的鸡淋巴细胞增生性肿瘤疾病。其特点是在鸡外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤出现淋巴样细胞、单核细胞的浸润和增生及肿瘤的形成。鸡马立克氏病病毒（MDV）归属于疱疹病毒科。MDV在流行过程中经常出现变异毒株，其共同特点是毒力比一般毒株强，有极强的肿瘤性，用HVT免疫的鸡不能阻止其致瘤性。MDV分3个型，Ⅰ型为致病性强毒株及其致弱毒株，Ⅱ型为无致病性的自然弱毒株，Ⅲ型为火鸡疱疹病毒（HVT），此型病毒本非MDV，但因与鸡马立克氏病关系密切，故将其划分在马立克氏病毒型内。     

传染性法氏囊病病毒中间株有关特性的研究

CEF－9是传染性法氏囊病病毒超强毒株vvIBDV-Gx在鸡胚成纤维细胞上传代致弱过程中的第9代毒。我们对其分子生物学及生物学特性进行了研究，结果表明其VP2基因序列即具有超强毒的特性，又兼有部分致弱毒的特征；其致病性介于超强毒株和致弱株之间；在体内外均不稳定的，体外继续传代可继续致弱，回归体内可迅速返强。这说明CEF－9是vvIBDV驯化时，毒力强弱转化的中间过渡形式。     

缺失部分miRNA的重组马立克氏病病毒致病性研究

马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的T淋巴细胞增生性疾病.为了研究MDV编码的miRNA与致瘤性的关系,通过对缺失部分miRNA的MDV-MS毒株进行动物感染试验,并将其结果与MDV-MS强毒株的致病性的试验结果进行比较.结果表明:缺失miRNA的重组MDV对无特定病原体(SPF)鸡无致病性,而接种MDV-MS毒株的SPF鸡却显示出很强的MD典型症状.此结果证实MD V编码的miRNA对MDV的致瘤性起到重要的作用.另外,通过对重组MDV感染鸡的羽髓病毒载量的动态检测,发现此处编码MDV-miRNA的基因为复制非必须区,但重组病毒rMS△miR9-12比亲本病毒MDV-MS的体内复制能力有所下降.     

鸡肿瘤病料中马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒共感染的研究

采用细胞培养、间接荧光抗体试验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)和斑点杂交(Dotblot)的方法从我国不同地区发生肿瘤的病料中同时进行MDV和REV的分离和鉴定。在分离到的13株MDV野毒株中，有4株培养物既能在IFA中与REV的单抗反应，又可以用PCR扩增出REV的LTR；另有4株培养物能扩增出REV的LTR，但在IFA中却不与REV的单抗反应。结果表明我国MD肿瘤中存在着REV的共感染，且我国MDV某些野毒株的基因组中有可能已经整合进了REV的LTR序列。     

马立克氏病病毒的分离和鉴定

从长春、天津、大连地区分离到10株马立克氏病病毒(MDV),经电镜观察、琼脂扩散试验、痘斑及蚀斑形成试验,均符合MDV的特点.通过MDV单克隆抗体、鸡胚细胞培养及致病性试验等鉴定,10株病毒均为血清I群MDV.火鸡疱疹病毒疫苗对其中的C-4株的保护率低于京-1株(P<0.01),而对其它株的保护率与京-1株差异不显著(P>0.05).     

重组马立克病毒通用转移载体的构建及初步应用

本实验以独立启动子控制的增强型绿色荧光基因(GFP)作为报告基因,同时将CMV启动子及其多克隆位点与之连接,构成外源基因表达盒,插入到马立克病毒(MDV)复制非必需区基因(短独特区US2等)构成的同源臂中,构建成重组马立克病毒的通用载体。鉴定正确后,将转移载体与提取的MDV基因组共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),同源重组获得具有感染性的重组病毒,待病毒蚀斑出现后,荧光显微镜下观察,可见到明显的绿色荧光病毒蚀斑,经三次筛选,初步分离到重组病毒。结果表明,转移载体与MDV基因组共转染可获得感染性病毒,US2基因可作为重组病毒构建中的外源基因插入位点,证实通用转移载体的构建是可行的,为重组马立克病毒新型疫苗的研究奠定物质基础。     

马立克氏病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以马立克氏病毒814株(MDV-814)作为免疫用抗原,建立了2个MDV特异性单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株—4A6、3D7。鉴定结果表明;两株细胞所分泌的McAb均为IgM类免疫球蛋白,具有MDVⅠ型病毒特异性,无中和反应特性和沉淀反应特性。利用两种McAb对国内标准强毒MDV-京1株进行鉴定,肯定其为MDV-Ⅰ型毒株。     

Cloning and Sequence Analysis of Meq Gene of Marek's Disease Virus Guangxi Strain

To investigate genetic variation of Marek's disease virus(MDV) in Guangxi province, three isolates of MDV were isolated from infected chicken.One pair of primers for amplifying Meq gene of MDV was designed according to nucleotide sequence in GenBank, Meq gene of the isolates were amplified by PCR, and then cloned, sequenced and compared with reference MDV strains published in GenBank.The results showed that Meq gene from all of the MDV isolates consisted of 1020 bp, coding for 339 amino acids.Compared with reference strains published in GenBank, the sequences of Meq gene in different isolates were relatively conserved and the homologies of nucleotide and amino acid sequence of the isolates were 83.8% to 99.9% and 88.4% to 99.6%, respectively.The proline-rich repeats of Meq gene of the MDV isolates had site mutations, and it was related to MDV's virulence.The isolate were nearly related to YL and GXY2, and far away from RB1B, GA, Md5, 648A and the immune strain phylogenetically.The study would provide research materials for the prevalence, genetic variation, protection and control of MDV in China.     

鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒(MDV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示, Meq基因序列全长为1020 bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

马立克氏病病毒“814”疫苗株基因组重复区序列测定及分析

为了解马立克氏病病毒(MDV)强、弱毒株主要致肿瘤相关基因变异情况,本研究根据MDV GA株基因组序列,设计合成扩增基因组重复区的引物,得到MDV814疫苗株病毒基因组中约26kb的序列片段。与GenBank登录的强、弱毒株进行比较分析表明,扩增的MDV1型814疫苗株的长重复区为12774bp,预测的开放阅读框(ORF)有48个;短重复区为11426bp,预测的ORF有38个。发现了4个MDV814株特有的ORF。814株在编码Meq、RLORF6和23ku的重叠基因内具有类似于疫苗株CVI988的177bp的插入;在RLORF12基因编码区内存在69bp的缺失,该缺失位于病毒复制起始位点内。同时,发现7个814疫苗株特有的氨基酸突变,分布在6个ORF内。单核苷酸多态性(SNP)的鉴定发现,多个基因具有单核苷酸的突变,主要分布于Meq基因,其中氨基酸A115V(丙氨酸-缬氨酸),N142D(天冬酰胺-天门冬氨酸)的变异是814疫苗株所特有的。MDV814疫苗株重复区的基因序列的比较分析将有助于MDV致肿瘤机制的研究。     

一例A亚型禽白血病病毒引起的纤维肉瘤的病理学和病毒学分析

将禽白血病A亚型（Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A）SDAU09C3毒株人工感染SPF引起的肾脏和肝脏纤维细胞样肉瘤进行病理组织学观察,同时检测是否有其它肿瘤相关病毒感染,另外,应用PCR扩增病毒囊膜蛋白gp85基因,并对其基因编码的氨基酸序列与原攻毒株比较分析。结果显示,SDAU09C3毒株引起的肿瘤,主要为纤维细胞肉瘤,胶原纤维较少,细胞及纤维排列极不规则。病毒学检测证明发病鸡只存在ALV-A的感染,而ALV-J、马立克氏病病毒（Marek＇s disease virus,MDV）、网状内皮增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）均为阴性。所分离的ALV-A病毒的囊膜蛋白gp85基因编码的氨基酸序列与原攻毒株同源性为99.5%。     

Isolation and Identification of a Field Strain of Marek's Disease Virus and Analysis of Major Pathogenic Genes

In a certain area of Shandong province, Marek's disease (MD) occurred in diseased chickens that had been vaccinated by turkey herpesvirus.In order to isolate the virus strain and detect the virus pathogenicity, agar diffusion test, cell culture and indirect immunofluorescence assay (IFA) were used to isolate the Marek's virus from chicken's blood and feather marrow.The isolated strain was adapted to grow in chick embryo fibroblasts (CEF).Genes involved in pathogenesis of MDV, such as meq, pp38 and 132 bp repeat sequence were amplified by PCR.The obtained sequences were compared with that of standard strains published in GenBank by DNAStar software.The results showed that pp38 gene of the SDAU-1 shared homology from 100% with standard virulent sequence.Analysis of 132 bp repeat sequence and meq gene sequences of the viral genome showed that the isolated virus belongs to the highly virulent MDV strains.     

一株鸡马立克氏病病毒的分离鉴定及主要致病基因分析

山东省某地区鸡马立克氏病疫苗免疫鸡群暴发马立克氏病(MD),为分离得到致病毒株,检测其致病性,采用琼脂扩散试验、细胞培养和间接免疫荧光试验(IFA)等方法从发病鸡的血液及羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞(CEF)生长的马立克氏病病毒。采用PCR方法扩增分离毒株的meq、pp38、132bp重复序列等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比对分析。结果显示,该分离株SDAU-1的pp38基因与标准强毒序列同源性为100%,132bp重复序列的拷贝数及meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征。