蓝氏贾第鞭毛虫检测技术研究进展

蓝氏贾第鞭毛虫是一种分布广、危害严重的水源性人兽共患的寄生虫原虫,可致人和动物严重腹泻.由于其种类繁多,易传染,传播快,对公共卫生安全造成严重威胁.传统的贾第鞭毛虫检测方法主要为粪便样本的显微镜检查.随着免疫学和现代分子生物学的不断发展,很多分子生物学检测技术不断涌现,并成功应用到对贾第鞭毛虫的快速检测.论文就近年来贾第鞭毛虫的检测技术进展情况进行综述.     

牦牛粪样中蓝氏贾第鞭毛虫巢式PCR检测方法的建立

采用建立的巢式PCR方法检测了297份牦牛粪样。结果表明:建立的巢式PCR方法一扩的最佳退火温度为55℃,二扩的最佳退火温度为53℃;对牦牛源贾第鞭毛虫的最低检测量为1个虫体DNA/m L;特异性试验表明,对隐孢子虫、弓形虫、柔嫩艾美尔球虫、阿米巴虫、牛巴贝斯虫等寄生虫DNA的扩增均为阴性;297份牦牛粪样中贾第鞭毛虫的检出率为7.4%。表明建立的方法具有较高的敏感性和特异性,可用于牦牛源贾第鞭毛虫感染的检测。     

使君子提取物体外抗蓝氏贾第鞭毛虫效果的研究

为了观察中药使君子提取物体外抗蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)的作用效果,试验分别采用乙醇和去离子水对使君子进行提取,得到使君子醇提物和使君子水提物,设置使君子醇提物组、使君子水提物组、甲硝唑对照组(3组各分别设置0.312 5,0.625,1.25,2.5,5 mg/mL5个药物浓度)及空白对照组(TYI-S-33培养基),分别在37℃厌氧培养滋养体浓度为8.0×10⁵～4.2×10⁶个/mL的贾第虫24 h,收集贴壁虫体,计算半数抑制浓度(IC₅₀);用IC₅₀的使君子醇提物、使君子水提物和甲硝唑分别作用于贾第虫,依次培养0,2,4,6,8,12,24 h,同时设空白对照,计算出药物达IC₅₀的最短作用时间;对作用时间分别为6 h和12 h的使君子醇提物组和空白对照组进行倒置光学显微镜、扫描电镜和透射电镜下观察,分析使君子醇提物对贾第虫滋养体超微形态结构的影响。结果表明：三种药液对贾第虫均有一定的抑制作用。使君子醇提物、使君子水提物和甲硝唑的IC₅₀分别为...     

青海省海晏县犬粪样中贾第鞭毛虫的检测

从青海省海晏县采集10只牧羊犬粪样用于贾第鞭毛虫检测.所有样品经饱和盐水浓缩法和蔗糖密度梯度离心等方法处理后采用光学显微镜、免疫荧光试验(IF)和套式PCR方法进行检测.结果显示,其中1个样品为阳性(10％),PCR扩增片段长度为274 bp,命名为QHGC201101株.测序结果与肠贾第鞭毛虫3VR株(HQ616609)核糖体小亚基RNA的同源性为100％,表明分离的虫种为肠贾第鞭毛虫,属于人兽共患型病原.     

蓝氏贾第虫致病机制的研究进展

蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)是一种重要的人畜共患寄生虫,可引起人和多种哺乳动物的腹泻。近年来人们对其致病机制进行了大量研究,包括贾第虫结构蛋白(贾第素)和排泄分泌物,表面抗原变异以及贾第虫对小肠的影响等,本文对此进行了综述。     

隐孢子虫和贾第鞭毛虫双重实时荧光PCR检测方法的建立

本研究根据隐孢子虫和贾第鞭毛虫相对保守序列,设计2对引物及其相应的Taqman探针,通过对引物和探针浓度、Taq酶以及反应条件等优化筛选后,建立了能同时检测隐孢子虫和贾第鞭毛虫的双重实时荧光PCR方法。所建立的隐孢子虫和贾第鞭毛虫双重荧光PCR检测方法的灵敏度为10-9,相当于46.1copies/!L,重复性好,特异性佳。本研究建立的双重荧光PCR技术,可以快速、准确地于一管一次反应检测隐孢子虫和贾第鞭毛虫。     

宁夏部分地区奶牛贾第鞭毛虫分子流行病学调查

为了明确宁夏地区奶牛贾第鞭毛虫的优势基因型及其流行特征,试验首先于宁夏地区10个规模化奶牛养殖场采集880份奶牛粪便样品,针对贾第鞭毛虫保守基因——β-贾第素(β-giardin, βg)基因序列设计引物,然后以提取的粪便样品全基因组DNA为模板进行巢式PCR,将PCR产物的测序结果进行BLAST比对分析,鉴定贾第鞭毛虫的基因型,并建立系统进化树,最后对宁夏地区不同城市、不同月龄及腹泻和非腹泻奶牛粪便样品的感染阳性率和基因型进行统计。结果表明：880份粪便样品中,有145份样品扩增到大小为510 bp的条带,贾第鞭毛虫感染阳性率为16.5%(145/880),其中集聚体A的占比为1.4%(2/145),集聚体E的占比为98.6%(143/145);所有集聚体A的βg基因为1种序列(已上传至GenBank,登录号为OQ101261 1NX),所有集聚体E的βg基因为4种序列(已上传至GenBank,登录号分别为OQ101262 2NX、OQ101263 3NX、OQ101264 4NX和OQ101265 5NX);OQ101261 1NX(奶牛)与MK5773339.1(藏牛)、MF49...     

丙硫苯咪唑对犬贾第鞭毛虫病的疗效

通过３组实验评定丙硫苯咪唑对犬贾第鞭毛虫病的疗效。实验１给犬一次口服丙硫苯咪唑２５ｍｇ／ｋｇ，７只犬有５只的粪便贾第鞭毛虫孢囊被清除（硫酸锌浓度方法确定）。未治疗的７只犬有３只粪便孢囊被清除。实验２给犬口服丙硫苯咪唑２５ｍｇ／ｋｇ，隔１２小时一次，共４次。５只犬的粪便孢囊全被清除，未治疗的５只对照犬，一只犬的粪便孢囊被清除。实验３给犬口服丙硫苯咪唑２５ｍｇ／ｋｇ，隔１２小时一次，共４次，２０只犬中     

猫贾第鞭毛虫感染的诊治

贾第鞭毛虫病(Giardiasis)是由贾第鞭毛虫(Giardia,简称贾第虫)引起的一种以腹泻为主要症状的肠道疾患。贾第鞭毛虫是世界各地人类和绝大多数动物的肠道内原虫。起初贾第鞭毛虫仅被视为一种共生性的肠道原虫,自1976年以来,由于世界各地相继发生本病,甚至暴发流行,人们才真正认识其致病性。     

中国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长cDNA克隆及序列测定

从中国人源蓝氏贾第虫北京株(BEIJ88／BTMR1／1)体外纯培养的电镜负染和超薄切片观察到蓝氏贾第虫病毒粒子。该病毒位于感染早期贾第虫的细胞质中，感染晚期的细胞核中。根据国外发表的蓝氏贾第虫病毒序列设计了6对互相重叠的引物。用这6对引物对从中国人源蓝氏贾第虫北京株发现的蓝氏贾第虫病毒基因组进行RT—PcR，将产物连接到pMD18-T载体中并转化入DH5a感受态菌，送上海生工测序，通过BLAST对Gen-Bank进行同源性搜索。结果 测得我国人源蓝氏贾第虫病毒基目组全长为6273bp，与国外报道的蓝氏贾第虫病毒序列同源性为95％，编码的氨基酸同源性为90％。     

斑点免疫金渗滤法检测赤羽病抗体的研究

以亲和层析原理为基础,将提纯的AKAV抗原包被在硝酸纤维膜上,利用胶体金标记SPA显色,建立了斑点免疫金渗滤法诊断赤羽病抗体的方法。其中最佳点样抗原质量浓度是0.099mg/mL,封闭液选择含1%BSA,0.5%Tween-20的0.01mol/LpH7.2的PBS缓冲液,SPA胶体金最佳稀释度为1∶4。特异性试验表明,该方法特异性好,与牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎、牛白血病、口蹄疫、蓝舌病等阳性血清不发生交叉反应。将DIGFA与ELISA进行对比,差异不显著。研究结果表明,该方法操作简单,结果易于判断,适用于赤羽病的临床诊断和流行病学调查。     

Development of an Immunobinding Assay with Monoclonal Antibodies to Diagnose Mycoplasma bovis in Semen

Veterinary Research Communications -     

应用斑点免疫金渗滤法诊断犬弓首蛔虫病

根据免疫渗滤原理,采用犬弓首蛔虫抗原蛋白和胶体金标记SPA,建立抗犬弓首蛔虫抗体的斑点免疫金渗滤法(D IGFA)检测200份犬血清样本。结果:阳性检出率为8.00%(16/200);血清样本对应犬粪便用饱和盐水漂浮法检查虫卵,阳性检出率为2.0%(4/200)。结论:斑点免疫金渗滤法具有操作简便、灵敏度高、特异性强的优点,可用于犬弓首蛔虫病的早期、快速检测。     

两株犬源贾第虫tpi基因的基因型分析

采用巢式PCR鉴定广东两株犬源贾第虫(GD1和GD2)的基因型。运用碘液染色对犬粪便中贾第虫进行鉴定,提取DNA后经巢式PCR扩增tpi基因,扩增产物测序后用BLAST和DNAStar软件进行同源性和系统发育分析。结果表明,通过tpi基因分析,GD1与L02120的同源性为100%,种系发育树上位于同一分支;GD2与DQ220289的同源性为99.1％,种系发育树上两者在同一分支。广东犬源贾第虫GD1为人畜共患的A1型,GD2为犬的D型。     

应用间接血凝试验检测伊氏锥虫循环抗原

利用间接血凝试验,对人工感染伊氏锥虫的马、豚鼠,家兔的循环抗原(CA)及其出现规律进行了实验检测。结果,感染动物47/57 CA阳性,15分份锥虫培养液CA全为阳性,而健康动物及空白培养液均为CA阴性。伊氏锥虫CA与锥虫属以外的驽巴贝西虫,传贫、鼻疽等血清不交叉,而与锥属的牛泰氏锥虫、路氏锥虫、马媾疫锥虫的血清有不同程度的交叉反应。CA比抗体出现早;感染动物完全治愈后,CA消失,而未彻底治愈者,CA仅暂时消失,但不久又出现,直到动物病死,由此认为,CA的检测可作为早期诊断、疗效判定和预后判定的依据之一。     

检测家畜血吸虫抗体的二步金标免疫渗滤法研究

将待检家畜血纸浸出液点在硝酸纤维素膜上，以金标记的血吸虫虫卵可溶性抗原为探针（以下简称血吸虫抗原胶体金），建立了检测家畜血吸虫抗体的二步金标免疫渗滤法（Two-step Dot Immunogold Filtration Assay，T—DIGFA）。家畜血吸虫病阳性血样在50-90S形成肉眼可观察的红色斑点，可进行快速诊断。该法可以检测出人工感染血吸虫尾蚴7d和7d以上的阳性牛和兔血纸抗体，与肝片吸虫、锥虫、蛔虫病之间无交叉反应。T—DIGFA检测粪孵血吸虫毛蚴阳性牛血纸139份、阴性牛血纸130份，与粪孵法阳性符合率为100％，阴性符合率为99．2％；T—DIGFA与斑点酶联SPA法阳性符合率和阴性符合率完全相同。血吸虫抗原胶体金在4～8℃保存期可达6个月、室温保存期为3个月。试验证实，T-DIGFA有很高的敏感性、特异性、重复性和稳定性，适合于基层单位和现场进行家畜血吸虫病抗体的快速诊断、普查和检疫。     

犬源贾第虫β-贾第素基因的克隆及序列分析

为了鉴定犬源贾第虫佛山分离株的基因型,根据GenBank中登录的贾第虫β-贾第素(bg)基因序列(X85958),设计2对引物GF1/GR、GF2/GR,采用套式PCR方法从贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段;将扩增产物纯化并连接到质粒载体pMD18-T,克隆转入感受态细胞JM109,挑选阳性克隆测序,然后进行序列分析。结果显示,犬源贾第虫bg序列长为384 bp,与预期目的片段一致;分子进化树表明该犬源贾第虫分离株为蓝氏贾第虫D型。该基因型在我国为首次报道,为贾第虫的分子鉴定以及分子遗传学研究奠定了基础。     

金免疫层析法检测囊虫循环抗原试验研究

应用胶体金和免疫层析技术进行了检测金免疫层析法(GICA)囊虫循环抗原(CA)试验研究。5株抗囊虫McAb和一株多抗用于最佳配对的筛选,一株用于标记胶体金,另一株包被NC膜。以双抗体夹心ELISA为对照,GICA用于CA检测,观察其敏感性、特异性和稳定性。结果显示,以McAb 1A5和1B6配对的结果最佳,1A5最适标记量为10μg／mL,186最佳包被浓度为1 g／L;用GICA和ELISA两种方法检测囊虫CA,痈猪血清和囊液的符合率达100％,病人血清和脑脊液的符合率达80％;CA最低检测量为10 ng,检测正常猪、人及其他疾病血清,均呈阴性;检测时间5-15 min,整个实验仅一步操作;GICA试纸条分别在4℃和室温下保存105 d以及在37℃保存45 d,检测结果均未发现改变。以上结果表明,快速检测囊虫循环抗原的金免疫层析法具有简便、快速、敏感、特异和稳定的特点,适合基层使用。     

斑点杂交法检测犬瘟热病毒

N蛋白是犬瘟热病毒核衣壳的主要构成成分,又是保守性较强的免疫原性蛋白。本研究对犬瘟热病毒N基因重组质粒酶切、凝胶回收目的DNA进行DIG标记制备探针,用此探针斑点杂交检测40只疑似犬瘟热患病犬鼻液和20只病死犬脾脏、肝脏、心脏、肺脏、肾脏、血液中的犬瘟热病毒。结果显示,40只疑似犬中,有33只是阳性,阳性率是82.5%,比胶体金诊断试纸阳性检出率高。而对病死犬的不同组织检测中,脾脏中病毒检出率最高,表明斑点杂交技术在犬瘟热病毒的早期诊断和流行病学调查中有很高的应用价值。