EGF对牛卵母细胞成熟及孤雌发育能力的影响

研究表明：表皮生长因子（EGF）对牛卵母细胞的成熟和孤雌激活后发育有促进作用。与对照相比,添加10 ng·mL^-1的EGF就可以明显提高牛卵母细胞体外成熟率、激活后的卵裂率和囊胚率。但EGF水平的提高,对提高卵母细胞成熟率的作用要高于提高后期胚胎发育的作用。40 ng·mL^-1的EGF的卵母细胞成熟率明显高于30 ng·mL^-1时的成熟率,但囊胚率未见明显提高。     

β-巯基乙醇对牛孤雌胚胎发育的影响

【目的】研究β-巯基乙醇(-βME)对牛卵母细胞核成熟和孤雌胚胎发育的影响。【方法】向OMM和SOF中添加0,0.05,0.10和0.15 mmol/L-βME,并在牛卵母细胞激活后,分别于1-细胞期、8~16细胞期、桑葚胚期向SOF中添加0.1 mmol/Lβ-ME,通过比较胚胎体外发育水平确定添加β-ME的最佳时期。【结果】-βME对牛卵母细胞核成熟无显著影响(P>0.05);0.05和0.10 mmol/Lβ-ME均可显著提高牛孤雌胚胎的卵裂率及囊胚发育水平,但以0.10 mmol/L-βME添加组的效果较佳;牛孤雌胚胎发育到1-细胞期和8~16细胞期前,添加0.10 mmol/L的β-ME,均可显著提高囊胚的发育水平(P<0.05),但1-细胞期添加-βME时的囊胚率、囊胚细胞数显著高于8~16细胞期组(P<0.05),故1-细胞期是添加-βME的最佳时机。【结论】-βME对牛卵母细胞核成熟无促进作用,但可提高牛孤雌胚胎的卵裂率并促使囊胚发育,且在8~16细胞期前添加-βME均可提高囊胚发育水平,但以1-细胞添加0.10mmol/Lβ-ME的促进效果最佳。     

异体颗粒细胞线粒体移植对牛孤雌激活胚胎发育的影响

为了探讨线粒体对孤雌激活胚胎发育潜能的影响,比较了异体颗粒细胞线粒体移植的牛孤雌激活胚胎、胚胎培养液移植的孤雌激活胚胎和正常孤雌激活胚胎的发育情况。结果表明,异体颗粒细胞线粒体移植组和胚胎培养液移植组的牛孤雌激活胚胎的激活率差异不显著(P>0.05),但均显著低于正常激活组(P<0.05);异体颗粒细胞线粒体移植组与正常激活组的孤雌激活胚胎卵裂率差异不显著(P>0.05),但均明显高于胚胎培养液移植组(P<0.05);异体颗粒细胞线粒体移植组的孤雌激活胚胎桑椹胚率极显著高于胚胎培养液移植组和正常激活组(P<0.01)。可见牛异体颗粒细胞线粒体移植可改善牛孤雌激活胚的发育。     

EGF对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液(含FSH)中分别添加10,30,50ng/ml表皮生长因子(EGF),24h后检查成熟率,并进行孤雌激活。结果表明:添加10ng/ml、30ng/mlEGF组牛卵母细胞成熟率较对照组(未添加EGF)无显著差异(79.8%vs71.5%vs70.4%,p>0.05),但EGF添加至50ng/ml时牛卵母细胞第一极体排出率显著提高,达85.4%(P<0.01);在实验1的基础上,比较培养液中添加10ng/ml、30ng/ml、50ng/mlEGF对牛孤雌激活胚胎体外发育的影响,结果发现在培养液中添加EGF并不能显著提高牛卵母细胞体外孤雌发育囊胚率(P>0.05),但可显著提高其囊胚孵化率(P<0.01)。     

LHRH-A3及EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

试验研究了在成熟培养液中添加促黄体素释放激素A3(Luteinizing hormone releasing hormoneA3,LHRH-A3)与表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)联合作用对猪卵母细胞体外成熟及孤雌发育的影响,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。结果表明,在猪卵母细胞体外成熟培养中,LHRH-A3可以代替孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotrophin,hCG);在孤雌发育中,LHRH-A3作用的效果明显高于添加PMSG和hCG组合;在联合应用处理中,剂量为1.5μg/mL LHRH-A3和40ng/mL EGF的组合对猪卵母细胞体外培养和孤雌发育的效果比较好。     

几种不同化学激活方法对牛卵母细胞孤雌激活的影响

为确定牛体细胞核移植胚胎的激活条件 ,比较了几种不同化学激活方法对牛卵母细胞激活的影响。选择明显具有第一极体的成熟卵母细胞 ,随机分为 9组 :1Ionomycin(I) +6 -甲氨基嘌呤 (D) (ID) ;2 I+D+细胞松弛素 B(CCB) (IDC) ;3I+放线菌酮 (X) (IX) ;4 I+X+CCB(IXC) ;5体积分数 7%乙醇 (E) +D(ED) ;6E+D+CCB(EDC) ;7E+X(EX) ;8E+X+CCB(EXC) ;9Sr2 + +CCB(SC)。Ionom ycin和乙醇的处理时间为 5min,6 - DMAP± CCB的处理时间为 4 h,放线菌酮± CCB的处理时间为 5 h,Sr2 + +CCB的处理时间为 10 h。培养36 h后 ,各组卵母细胞的卵裂率分别为 72 .0 % ,75 .5 % ,81.3% ,85 .1% ,81.7% ,82 .4 % ,74 .4 % ,78.1%和 5 1.0 % ;培养到 196 h时 ,各组的囊胚发育率分别为 18.2 % ,2 4 .5 % ,7.2 % ,11.9% ,11.1% ,19.4 % ,6 .7% ,12 .2 %和 2 .0 %。结果表明 ,在 10 mm ol/ L Sr2 +内培养 10 h不能有效地激活牛卵母细胞 ,Ionom ycin+6 - DMAP± CCB以及乙醇 +6 -DMAP+CCB结合使用可以有效地激活牛卵母细胞。Ionom ycin比乙醇对牛卵母细胞的激活作用强 ;6 - DMAP比CHX的激活效果好 ,激活液中 CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利     

EGF和不同血清对牛卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响

分离牛卵母细胞,分别用添加表皮生长因子(EGF)和发情牛血清(发情当天血清(OCS(0 d))和发情第7天血清(OCS(7 d)))的培养液进行成熟培养后去核,构建牛体细胞核移植胚并进行体外培养,研究EGF和OCS对卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响。结果表明EGF添加组和OCS(0 d)添加组卵细胞的成熟率及核移植胚的卵裂率和囊胚率分别为74.5%,84.6%,25.9%和83.9%,78.8%,31.3%。在牛卵母细胞成熟液中添加EGF、OCS(0 d)更有利于牛核移植胚胎的发育。     

小鼠卵母细胞孤雌激活及胚胎电融合研究

对小鼠的研究结果表明，７％酒精对１７ｈ和１９ｈ卵龄卵的激活率差异不显，但１９ｈ卵激活后的卵裂率显高于１７ｈ卵，酒精处理前去掉卵丘能使激活率提高的９０％－１００％，酒精处理时间之间差异不显。     

猪体内与孤雌激活早期胚胎发育特定阶段差异表达基因筛选

 【目的】研究早期胚胎发育基因,筛选猪早期体内发育胚胎和体外孤雌激活胚胎的差异表达基因,探讨影响胚胎发育的分子基础。【方法】分别采用孤雌激活和手术（猪体内发育）的方法收集2细胞、4细胞、8-16细胞时期的胚胎,利用SPEDDRT-PCR挑选不同时期的差异表达产物,将所获得的产物按照片段大小分离纯化后通过反向Northern杂交去除假阳性条带。将阳性条带克隆入T载体中,经过PCR鉴定后挑选其中的阳性克隆进行测序。【结果】筛选了11个代表不同时期表达差异的cDNA片段,编号为DDD1-DDD11。经过与GenBank数据进行同源性分析,发现其中DDD3、DDD11没有同源序列信息,提交数据库获得GenBank登录号（EU597224、EU597228）,其余序列发现相似性较高的数据。【结论】对体内正常发育胚胎和孤雌激活胚胎进行对比、分析,发现体内4细胞期和体内8-16细胞期各有1个片段为新基因片段,为进一步分析发育相关基因及其功能奠定基础。     

牛孤雌胚胎发育过程中泛素定位与线粒体分布的相关性

【目的】研究泛素(Ub)在牛孤雌胚胎发育过程中的表达定位及与荧光标记线粒体分布的关联性。【方法】将人工合成Ub基因插入真核表达载体pVenus的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pVenus-Ub,采用脂质体2000介导重组质粒pVenus-Ub转染Hela细胞,经荧光显微镜观察和PCR检测,探讨重组质粒pVenus-Ub在Hela细胞中的表达情况;用体外转录试剂盒将pVenus-Ub转录为cRNA并注射牛卵母细胞,选择成熟卵母细胞并将其经离子霉素孤雌激活后,在荧光显微镜下观察Ub的表达和定位情况;同时,用JC-1荧光染料对牛卵母细胞线粒体进行染色,观察线粒体的分布,探讨Ub定位与线粒体分布的相关性。【结果】重组载体pVenus-Ub能在Hela细胞中表达;Ub蛋白在牛体外成熟卵母细胞及孤雌发育过程中均有表达,分布于整个胞质中,并在皮质及核区分布较集中;成熟卵母细胞及早期孤雌胚胎中Ub蛋白与线粒体共定位。【结论】成功建立了Ub基因的真核表达体系及孤雌胚胎表达体系,且在牛孤雌胚胎发育过程中Ub的定位及与线粒体的分布相互关联。     

不同化学激活方法及卵丘细胞层数对牛体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

为探索适宜的牛体外成熟卵母细胞孤雌激活方式,提高核移植效率及研究胚胎孤雌发育。研究比较了不同浓度的乙醇( EH)、离子霉素(ionomycin)、钙离子载体A23187与蛋白激酶抑制剂6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、细胞松驰素(cytochalasin B, CCB)对牛卵母细胞激活发育的影响,并在相同条件下,比较了不同卵丘细胞层数对卵母细胞激活后胚胎发育能力的影响。结果表明: (1) 5 μmol·L-1 Ionomycin,10 μmol·L-1 A23187,7% EH分别联合2 mmol·L-1 6-DMAP,CCB均可以有效地激活牛孤雌胚,其中以Ionomycin＋6-DMAP+CCB组囊胚发育率极显著高于其他各组(P<0.01),并且激活液中CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利;(2) 卵母细胞包被的卵丘细胞层数不同对卵母细胞成熟激活有显著的影响,卵丘细胞层数3～5层和多于6层的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)孤雌激活的分裂率和囊胚率分别为69.09%,31.58%和75.14%,38.85%,这2组之间差异不显著(P>0.05), 但其显著高于1～2层组与混合组(P< 0.05), 因此,这2组细胞是最佳的试验研究材料。     

不同体外成熟时间对猪体外成熟卵母细胞孤雌胚胎发育的影响

对体外成熟33,41.49和57 h的猪成熟卵母细胞进行孤雌激活,并对激活后孤雌胚胎的囊胚发育率进行观察.成熟率方面,33 h组显著低于41,49和57 h组,分别为52.54%,79.19%,93.25%和93.75%(p＜0.05);卵裂率方面,41 h组显著高于57 h组,分别为92.26%和56.17%(p＜0...     

培养液体积对猪孤雌胚早期发育的影响

为了探讨培养液体积对猪早期孤雌胚发育的影响,旨在优化猪早期胚胎培养体系。试验一、二、三、四分别把30、20、15、10个枚孤雌激活胚放入60,45,30,15,10,5μL(10个胚胎)的培养滴,第48小时观察分裂率,第168小时观察囊胚形成率。结果表明:试验一:30~60μL组囊胚率略高于10~15μL组;试验二:60μL组的囊胚率略高;试验三:各组分裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05),但45~60μL组分裂率和囊胚率比其他组略高;试验四:15μL组分裂率高于45μL组(P<0.05),15μL组囊胚率显著高于5μL组(P<0.05),其余各组差异不显著。由此表明:30枚猪孤雌胚时,胚胎数∶培养滴体积=1∶(1~2)较好;15~20枚猪孤雌胚时,胚胎数∶培养滴体积=1∶3较好;10枚猪孤雌胚时,胚胎数∶培养滴体积=1∶1.5较好。     

六味地黄汤对发育迟缓胎鼠脑NGF、EGF表达影响

目的 观察补肾益髓经典方六味地黄汤对发育迟缓胎鼠脑神经生长因子（NGF）、表皮细胞生长因子（EGF）表达影响,并为宫细胞内脑发育迟缓的治疗提供支持。方法 10只孕鼠依照受孕先后顺序随机分成5组,正常组、模型组、六味地黄汤高剂量组、六味地黄汤中剂量组、六味地黄汤低剂量组,采用孕鼠被动吸烟复制胎鼠发育迟缓模型,正常组、模型组均灌胃蒸馏水,六味地黄汤高、中、低剂量组分别灌胃2.164、1.082、0.541 g/mL的六味地黄汤浓缩液。于孕19 d将5组孕鼠处死,称算每组活胎脑体质量比;采用免疫组化法检测胎鼠脑内NGF、EGF的表达。结果 被动吸烟可使胎鼠脑体质量比降低,六味地黄汤高剂量能增加脑体质量比;模型组NGF、EGF表达低于正常组（P<0.01）,治疗组NGF、EGF表达均高于模型组（P<0.01或P<0.05）。结论 孕期被动吸烟可以导致胎鼠脑发育迟缓,六味地黄汤能通过调控脑内NGF、EGF改善胎鼠脑的发育。     

牛胚胎体外培养体系的优化

将体外受精后的牛卵母细胞随机分组进行培养,比较了胎牛血清(FBS)和发情后7 d牛血清(E 7BS)、不同培养液(CR 1+3 m g/mL BSA、SOF+3 m g/mL BSA和SOF+0.1 m g/mL PVA)、共培养体系和不同培养液体积(0.1,0.5和2.0 mL)对胚胎发育的影响,优化了牛胚胎体外培养体系,并对该体系的稳定性进行了检验。结果表明,优化后的牛胚胎培养体系为:前48 h用CR 1+3 m g/mL BSA培养液,48 h后用CR 1+体积分数10%E 7BS培养液培养120 h,培养液体积为0.5 mL,并且采用共培养,受精后颗粒细胞保留48 h。用该培养体系培养的牛胚胎发育良好,平均囊胚率为44.9%,表明该优化培养体系较稳定。     

牛体外成熟卵母细胞孤雌激活的研究

比较 3种化学激活方法和 4种电化学激活方法对牛体外成熟卵母细胞进行孤雌激活的效果。结果显示 ,单独用离子霉素和用离子霉素 + 6 DMAP +CB或 +CHX +CB激活牛卵母细胞 ,两者之间差异极显著 (P <0 0 1) ;用不同强度电脉冲 + 6 DMAP +CB激活牛卵母细胞 ,各组间卵裂率差异均不显著 (P >0 0 5 )。结果表明 ,虽然电化学激活方法最高可获得 82 9%的卵裂率 ,比化学激活方法中最好的高 4 8% ,但后者不需电融合仪 ,操作相对简便。     

小鼠卵母细胞的孤雌激活与ES细胞样集落分离

对小鼠卵母细胞进行孤雌激活用于单性生殖研究。取成年昆明白小鼠进行超数排卵,乙醇激活,同小鼠输卵管上皮细胞共培养并添加mM16培养基培养至早期囊胚阶段,移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,换成ES细胞培养液继续培养,分离消化ICM,重新接种,对分离出的ES样细胞集落进行分离培养鉴定。结果显示,小鼠卵母细胞激活率为96.99%,2-细胞发育率为93.17%,桑椹胚发育率为80.33%,囊胚发育率为73.22%。小鼠孤雌激活囊胚中分离的ES样细胞集落具有一系列ES细胞所特有的特征,如呈现出岛屿状形态,碱性磷酸酶染色为阳性,体外能够自发分化成上皮样或单个散在分布的细胞等。试验证明,小鼠孤雌胚中可以分离出ES细胞样集落。