烟草花叶病毒南瓜分离物CP基因的克隆、序列分析及其原核表达

为从分子水平鉴定山东聊城的一表现明显花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜病毒病的病原.采用RT-PCR的方法,用TMV外壳蛋白(CP)基因的特异引物,对该样品进行了检测,克隆到的基因序列进行分析,并使其在大肠杆菌中表达.结果表明,从该样品中扩增到了TMV的CP基因,说明该样品受到TMV的侵染,首次发现TMV自然侵染南瓜.对CP基因序列测定及分析表明,与GenBank上其他TMV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为86.5%～99.0%,推导的氨基酸序列同源性为93.7%～99.4%.根据完整CP 基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:32个TMV分离物可分为5个组,其中TMV-liaocheng与Nakron Pathom、Fujian、017等分离物属于Ⅳ组.TMV-liaocheng可能发生过重组.将TMV-liaocheng CP基因与原核表达载体pET-22b(+)连接,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS诱导表达出分子量约20 kDa的融合蛋白,并用Ni2+ -NTA His · Bind(R)树脂纯化,纯化后的蛋白可直接用于制备特异性的抗血清,为准确、快速地检测TMV奠定了基础.     

草莓轻型黄边病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆草莓轻型黄边病毒CP基因,并构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达CP蛋白。利用SMYEV的检测引物,通过RT-PCR技术筛选带SMYEV的草莓植株;根据NCBI中SMYEV序列设计扩增CP基因全长引物,通过RT-PCR获得SMYEV沈阳分离物CP基因全长序列;将CP基因克隆到原核表达pGEX-6P-1上,利用IPTG诱导CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白。利用RT-PCR扩增获得SMYEV分离物SY05的CP基因全长序列,由729个核苷酸组成,编码242个氨基酸残基。SY05与其他SMYEV分离物的核苷酸同源性为80.1%～97.4%,氨基酸同源性为92.1%～99.6%,其中,与SMYEV分离物SY03的氨基酸一致性为98.3%。将SY05的CP基因成功克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建了重组表达载体p6P-EV-CP,并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导SMYEV分离物SY05的CP基因在大肠杆菌中表达出分子量为52.0 kDa的融合蛋白。克隆出SMYEV分离物SY05的CP基因,实现了其在原核细胞中的表达,为SMYEV抗血清的制备奠定了重要基础。     

莴苣花叶病毒北京分离物基因组3′末端序列分析

笔者通过RT-PCR方法对LMV北京分离物(LMV-BJ)基因组3'端1620nt的核苷酸片段进行了克隆和序列分析(GenBank登录号为EF423619)。所获片段含有NIb基因3'端的574nt,编码NIb C-端190个氨基酸;完整的CP基因,全长为834nt,编码一个由277个氨基酸组成的分子量约为30kDa的结构蛋白;3'非编码区含有209nt。通过序列分析软件将LMV-BJ与已经报道的法国分离物O(X97704)、法国分离物E(X97705),美国分离物(X65652),巴西分离物(AJ278854)和余杭分离物(AJ306288)基因组3'末端和CP基因的核苷酸序列与氨基酸序列分别进行了比较。     

天津地区番茄褪绿病毒的分子检测与基因组部分序列分析

为了确定天津番茄产区是否发生了番茄褪绿病毒病,了解该病毒天津分离物的主要基因是否发生变异,对该地区发生的To CV进行了分子检测,并对该病毒的外壳蛋白(CP)和热激蛋白70类似物(Hsp70h)的核苷酸和氨基酸进行了序列分析。结果表明,天津分离物CP蛋白的核苷酸和氨基酸序列与已报道的具有代表性的不同国家的分离物相似性均在97.3%以上。Hsp70h蛋白的核酸和氨基酸序列与已报道的具有代表性的不同国家的分离物相似性均在97.2%以上。表明CP和Hsp70h蛋白是2个最保守的蛋白。这是首次在分子水平上证明番茄褪绿病毒在天津地区为害。     

草莓轻型黄边病毒北京分离物的CP基因序列分析

为了明确引起北京地区草莓病毒病的病毒种类和病毒序列的分子变异特点,从北京地区表现畸形症状的草莓叶片中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)的含有外壳蛋白(CP)基因的729 nt特异性核苷酸片段。经序列测定和分析可知,北京地区存在2种不同的SMYEV分离物（BJ1和BJ2）,两者间的核苷酸序列同源性仅为82.72%~82.96%。将北京分离物与分别来自德国、美国、智利、捷克、澳大利亚、比利时、意大利、韩国和中国沈阳等国家或地区的不同分离物的CP基因序列进行分析比较。结果显示,33个分离物可以分为四大组群,BJI和BJ2分别归属不同组群,BJ1与19个其他国家的分离物亲缘关系较近,BJ2与中国沈阳的2个分离物亲缘关系较近。BJ1和BJ2与其他分离物的CP基因核苷酸序列同源性分别为81.10%~98.35%和82.03%~98.63%,氨基酸序列同源性介于82.17%~99.17%和90.91%~94.63%。     

基于小RNA技术的天津地区番茄花叶病毒分子检测与基因组部分序列分析

为了明确引起天津地区番茄果实褐化的病因,采用小RNA深度测序技术和RT-PCR技术对采自天津的番茄病样进行鉴定分析。结果表明,引起天津地区番茄果实变褐的病原为番茄花叶病毒。进一步对该病毒进行了全基因组测序,并对该病毒的外壳蛋白(CP)、运动蛋白(MP)和126蛋白进行了序列分析。进化树分析结果表明,天津分离物的3个蛋白基因均与美国分离物USA_99-1)的进化关系最近。相似性分析结果表明,CP基因与其他分离物的平均相似性为95.53%。MP基因与其他基因分离物的平均相似性为95.21%。126蛋白基因与其他分离物的平均相似性为92.72%。对这3个基因编码的蛋白进行分析,结果表明,不同分离物之间的平均相似性均在99.0%及以上。初步表明,在天津发生的番茄花叶病毒可能是由于贸易活动由国外传入天津市。     

李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究

为制备李矮缩病毒(Prunus dwarf virus, PDV)抗血清,克隆PDV外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料,提取总RNA,根据PDV CP基因(L28145.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-PDVCP,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达。PDV CP基因（Genbank登录号：JF333587.1）全长657 bp,编码217个氨基酸,与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.2%~93.9%,推导的氨基酸序列同源性为97%~99%。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示：12个PDV分离物可分为3组,泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于Ⅰ组。成功构建原核表达载体pET30a-PDVCP,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a-PDVCP载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h表达量最大。     

宁夏地区马铃薯X病毒分离及其CP基因克隆

马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)对马铃薯生产影响较大,不同区域内PVX存在多样性和株系差异。本研究通过指示植物法和分子生物学鉴定法,从宁夏隆德县区域内的感病马铃薯上分离到一株马铃薯X病毒(PVX-NX1)。利用RT-PCR技术,克隆该病毒的外壳蛋白(CP)基因,序列分析结果表明,CP基因全长714 bp,编码237个氨基酸残基,与已报道CP基因的核苷酸序列同源性为72.42%~97.34%,氨基酸序列同源性为91.53%~100%。其中,与荷兰分离物X3(属PVX的X3株系)、中国新疆的核苷酸序列同源性分别为96.36%、97.34%,氨基酸同源性均为100%。初步确定PVX-NX1属PVX的X3株系。     

辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)新疆加工型辣椒分离物的鉴定和致病型分析

为明确侵染新疆南疆巴州加工型辣椒主产区的辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的致病型,利用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和基因克隆、序列分析对南疆巴州加工型辣椒主产区的辣椒病样进行PMMoV的检测及其致病型鉴定。结果表明,从辣椒植株、椒果及种子样品中均检测到PMMoV。通过对预期576 bp大小的3个PMMoV扩增产物进行克隆、测序和序列分析表明,PMMoV新疆加工型辣椒分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与已报道的PMMoV分离物具有较高同源性,分别为89.0%~99.2%和95.5%~100.0%;其中,与PMMoV以色列分离物EF434393同源性最高,PMMoV新疆各分离物之间CP基因高度同源。依据CP基因序列及系统发育分析将PMMoV新疆加工型辣椒分离物划分为P_1,2致病型。     

温州蜜柑CYVCV的CP基因克隆和序列分析

柑橘黄化脉明病(citrus yellow vein clearing,CYVCD)是一种危害柑橘的病毒病,克隆分析病原物序列信息对研发高灵敏检测方法具有重要意义.本研究从寻乌县温州蜜柑寄主上获得包含CYVCV的提取物,克隆CYVCV外壳蛋白(coat protein,CP)基因进行扩增测序和生物信息学分析.结果 表明,温州蜜柑叶片的CYVCV分离物的CP基因全长978 bp,编码325 aa,温州蜜柑CYVCV的CP基因序列与GenBank中收录的CYVCV的CP基因核苷酸和氨基酸序列相似度在97.1％～99.6％和95.5％～99.8％之间,与同为柑橘属的2种环斑病毒(ICRSV-K1和ICRSV-PU) CP基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性在74.0％～71.1％之间.与α线性科的其他病毒相似度均低于40％.在系统进化树中,系统发育树将CYVCV的CP分为3个类群,寻乌县温州蜜柑的CYVCV的CP蛋白与湖南甜橙和重庆尤里卡柠檬分离物CP蛋白聚成一簇,表明它们之间亲缘关系更近.本研究结果表明CYVCV的CP基因具有一定的分子差异,但变异比较保守,各地不同宿主间CYVCV亲缘性较高,这为进一步检测应用打下基础.     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株HQ0806的分离与鉴定

通过对辽宁阜新近郊某鸡场数群 15 日龄左右的病鸡的临床症状、病理变化、病毒分离、纯化、动物回归、血清学检测、病毒形态观察等检测, 分离到一株鸡传染性法氏囊病病毒并命名为HQ0806。研究表明：该病毒效价达到10-5.8/ 0.2ml,在动物回归试验中其引起发病率为100％,死亡率达83％,剖检可见法氏囊呈“紫葡萄样”外观,胸腺萎缩,骨髓脂肪化等病变,表现了超强毒株的致病特点。     

福建地区草莓斑驳病毒全基因组测序和分子变异分析

为了深入解析草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)的分子变异以及遗传多样性,采用小RNA高通量测序结合RACE和RT-PCR技术获得了福建地区SMoV基因组全长序列。SMoV基因组RNA1和RNA2分别为7034 nt和6354 nt,均含有1个ORF,分别编码多聚蛋白P1和P2;SMoV福建分离物同其他15个SMoV分离物的同源性分析表明,RNA1核苷酸和多聚蛋白P1氨基酸同源性分别为79.2%~96.8%和89.0%~99.5%;RNA2核苷酸和多聚蛋白P2氨基酸同源性分别为77.9%~97.8%和89.9%~98.9%。SMoV福建分离物各编码蛋白同其他15个SMoV分离物的同源性分析表明,仅病毒基因组连接蛋白最为保守,其他各蛋白核苷酸序列和氨基酸序列变异均较大。福建分离物和中国部分分离物聚在一个大分支上,和中国分离物DGHY3亲缘关系最近。SMoV中国福建分离物的基因组结构与其他分离物相一致,其核苷酸序列和氨基酸序列分子变异较大,并且和中国其他分离物具有较丰富的遗传多样性,在进化上有一定的地理相关性。     

小麦地方品种小白冬麦抗白粉病基因分子标记

小麦农家品种小白冬麦对小麦白粉病具有良好抗性,对病原菌拥有较广的抗谱,并与其他已知抗白粉病基因的抗谱不同,遗传分析证实小白冬麦的苗期抗性由一个隐性抗白粉病基因控制。为了寻找与小白冬麦所携带抗白粉病基因连锁的分子标记,采用小白冬麦和感病品种Chancellor(CC)正反交组合,在2个F₂群体125和107个单株上进行验证。结果显示,抗白粉病基因mlxbd与引物Xgwm577、Xgwm1267等紧密连锁,通过中国春及其第7部分同源群缺体-四体系,双端体系和缺失系将其定位在7B染色体长臂末端区域(7BL-10,Bin 0.78~1.00), 利用与mlxbd最近的引物Xgwm577扩增23个含有已知抗白粉病基因的小麦品种,检测发现这个引物不能单独用于分子标记辅助选择育种。     

Identification of <Emphasis Type="Italic">Ascochyta rabiei</Emphasis> disease resistance in chickpea genotypes

Ascochyta blight (AB) disease, caused by the fungus Ascochyta rabiei, is a major yield limiting factor of chickpea in Australia and around the world. The aggressiveness of six A. rabiei isolates was identified using 3 chickpea varieties (Jimbour, Flipper and Yorker). These AB isolates were isolated from chickpea fields in northern NSW, one of the major chickpea production regions in Australia. Each of the six isolates produced a different aggressiveness pattern and isolate 4859 was found to be the most aggressive. The AB resistance in 16 international and Australian chickpea genotypes was then investigated by inoculating the plants with the most aggressive isolate and a mixture of the other 5 isolates. Resistance to both the most aggressive isolate and the mixed isolates has been identified in 5 genotypes (ICCV 98813, Flipper, ICCV 05111, ICCV 98801, Jimbour #1) while 10 entries (Howzat, ICCV 06108 and ICCV 98818, Jimbour, ICCV 96852, ICCV 06107, ICCV 98816, Yorker, FLIP97-114C, ICCV 96853) were moderately resistant. Only one genotype (Bumper) appeared to be susceptible to both inoculums. There was large variation observed in the pathogenicity of the isolates suggesting that the six AB isolates represent several different pathogen strains. Significant differences in leaf infection rate, plant infection rate, plant death rate and disease development were identified among the chickpea genotypes tested. These findings suggest that these chickpea genotypes carry different resistant genes, which can be exploited in breeding programmes to develop high levels of disease resistance.     

Evaluation of common wheat cultivars for tan spot resistance and chromosomal location of a resistance gene in the cultivar 'Salamouni'

A total of 50 wheat (Triticum aestivum L.) cultivars were evaluated for resistance to tan spot, using Pyrenophora tritici‐repentis race 1 and race 5 isolates. The cultivars ‘Salamouni’, ‘Red Chief’, ‘Dashen’, ‘Empire’ and ‘Armada’ were resistant to isolate ASC1a (race 1), whereas 76% of the cultivars were susceptible. Chi‐squared analysis of the F₂ segregation data of hybrids between 20 monosomic lines of the wheat cultivar ‘Chinese Spring’ and the resistant cultivar ‘Salamouni’ revealed that tan spot resistance in ‘Salamouni’ was controlled by a single recessive gene located on chromosome 3A. This gene is designated tsn4. The resistant cultivars identified in this study are recommended for use in breeding programmes to improve tan spot resistance in common wheat.     

二价核酶基因构建及对PLRV负链靶序列的体外切割研究

根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)中国分离株(PLRV-Ch)复制酶基因负链RNA的二价核酶序列。将该核酶基因克隆到pGEM-4Z中,构建成体外转录载体pGEM-4ZDR;同时将包含核酶切割识别位点的PLRV-Ch复制酶基因cDNA近5’端的874 bp片段反向插入到pGEM-4Z中,构建了体外转录载体pGEM-4ZR5。以线性化的重组质粒pGEM-4ZDR和pGEM-4ZR5为模板,在T7 RNA聚合酶的作用下,分别转录获得核酶RNA和PLRV-Ch复制酶基因5’端负链RNA底物片段。将以上2种RNA转录物混合并经37℃保温后,检测结果表明,所得核酶RNA对PLRV-Ch复制酶基因负链RNA在体外具有较强的特异切割活性。     

来自野生二粒小麦的抗白粉病基因PmAS846及其染色体定位和分子标记分析

N9738是经抗性定向选择和农艺性状筛选所培育的抗白粉病普通小麦新种质,携带来自野生二粒小麦As846的抗白粉病基因PmAS846,在苗期和成株期高抗白粉菌生理小种E09和陕西关中地区流行菌系,本研究对该种质携带的抗白粉病基因进行了染色体定位和分子标记分析。对N9738和高感小麦白粉病的普通小麦品种辉县红杂交的F₁、F₂代分离群体和F_2:3代家系进行白粉病抗性鉴定和遗传分析证实,N9738苗期抗性由1个显性抗白粉病基因控制,单(缺)体分析将该基因定位在小麦5B染色体上。采用位于5B染色体的分子标记结合集群分离分析法(BSA法)分析,筛选出与PmAS846连锁的11个SSR标记和2个EST-STS标记,PmAS846两翼的SSR标记Xgwp3191和Xfcp1与该基因的遗传距离分别为7.3 cM和1.8 cM,EST-STS标记BF202652和BF482522与该基因的遗传距离均为5.1 cM。根据该基因两翼SSR标记对中国春5B染色体缺失系(Bin系)的分析将其定位在5B染色体长臂0.75~0.76区域。研究结果为PmAS846的分子标记辅助选择和精细定位奠定了基础。     

Recessive genes controlling resistance to Helminthosporium leaf blight in synthetic hexaploid wheat

A study was conducted under controlled environment conditions in a phytotron to determine the nature of the inheritance of resistance Helminthosporium leaf blight (HLB) in a synthetic hexaploid wheat line, ‘Chirya‐3’, against the isolate KL‐8 of Bipolaris sorokiniana from the major wheat growing region of India. Crosses were made between two susceptible lines ‘WH 147’ and ‘Chinese Spring’. Analyses of F₁ and F₂ populations of these two crosses (‘WH 147’בChirya‐3’ and ‘Chinese Spring’בChirya‐3’) showed that resistance against the isolate in ‘Chirya‐3’ was governed by two recessive genes functioning in a complementary interaction giving an F₂ segregation pattern of 1 : 15 (resistant : susceptible). The segregation pattern of the resistant F₂ progenies in F₃ families from both crosses confirmed that two homozygous recessive genes were responsible for resistance to the isolate of Bipolaris sorokiniana in the synthetic line ‘Chirya‐3’. It is proposed that the genes be designated as hlbr1 and hlbr2.     

小麦抗白粉病新基因的AFLP和SSR标记及其染色体定位

M53 (YAV2/TEZ//Ae.squarrosa 249) 是硬粒小麦与粗山羊草的双二倍体合成种,携带一个抗白粉病新基因,暂命名为Pm-M53,该基因对北京地区白粉病优势生理小种15号表现免疫抗性。本研究利用来源于杂交组合M53/宛7107的一个F₂群体,在苗期采用白粉病15号小种（Blumeria graminis f. sp. tritici）接种,抗病反应型鉴定表明,抗感比例符合3∶1,说明其抗性受显性单基因控制;对部分F₂植株的F₃株系的抗病鉴定进一步证明了F₂鉴定的可靠性;利用AFLP和SSR标记技术结合F₂分离群体对目的基因进行了遗传作图,将目的基因定位在5D染色体的长臂上。其中AFLP标记P16M16_-109(Apm109)和P5M16_-161(Apm161)与目的基因的遗传距离分别为1.0和3.0 cM。SSR标记Xwmc289b、Xgwm583和Xgwm292与目的基因的遗传距离分别为20.0、33.0和24.0 cM。这些标记位于目的基因的两侧。利用中国春遗传背景的缺-四体和双端体结合AFLP标记Apm109确证了SSR标记定位的可靠性,进一步证明该基因是一个新的抗白粉病基因。     

Monosomic analysis of stem rust resistance in the wheat cultivar Almus

Summary Monosomic analysis of resistance to stem rust, race 11 (isolate G 425) was carried out in the cultivar Almus (GDR) possessing a 1B/1R translocation. F₂ progenies of monosomic and disomic F₁ plants of Almus crossed with 21 monosomic lines of Chinese Spring were tested. Two lines (1B and 6B) differed significantly from the disomic segregation ratio by a higher number of resistant plants and two other lines (1D and 6A) by a lower number of resistant plants. The results fitted a hypothesis comprising the interaction of two genes for resistance and two inhibitors.