纳豆芽孢杆菌NY-1产蛋白酶酶学性质研究

试验为研究纳豆芽孢杆菌NY-1产蛋白酶的酶学性质,在液体培养基中培养该菌株并获得粗酶液,之后分别在不同处理条件下对粗酶液中蛋白酶活性进行测定。结果表明,该酶最适反应温度为65 ℃,最适反应pH为9.0,45 ℃时有较好的热稳定性,pH 8.0~9.0有较好的pH稳定性。金属离子Mn²⁺和Zn²⁺对该蛋白酶活性有激活作用,Fe²⁺、Cu²⁺和Mg²⁺对酶活性有抑制作用。     

高产中性蛋白酶芽孢杆菌的筛选鉴定及酶学性质研究

为了获得高产中性蛋白酶芽孢杆菌菌株，试验从不同环境样本中分离细菌并进行16S rDNA序列鉴定，利用酪蛋白琼脂培养基对产蛋白酶菌株进行初筛、福林酚法检测中性蛋白酶活性，结合形态学和分子生物学鉴定对高产中性蛋白酶芽孢杆菌菌株进行分类鉴定，通过对培养时间、温度和pH值的调节，研究该菌株的酶学性质。结果表明：成功筛选出1株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)A1,该菌株具有较强产中性蛋白酶能力，中性蛋白酶活性为31.40 U/mL,所产中性蛋白酶的最适反应温度为50℃、最适pH值为7,在pH值=6～8时稳定性较好，对碱性环境有一定的耐受性，5.0 mmol/L的Ca²⁺和Mn²⁺对中性蛋白酶活性有显著促进作用(P<0.05),Zn²⁺和Fe²⁺对中性蛋白酶活性有抑制作用(P<0.05),Mg²⁺无明显作用。说明贝莱斯芽孢杆菌A1可以作为生产中性蛋白酶的备选菌株。     

产蛋白酶芽孢杆菌的筛选鉴定及酶学特性分析

为了分离筛选产蛋白酶芽孢杆菌,以开发新型饲料添加剂,本研究选取小鼠肠道内容物为样品,通过对样品进行预处理以及酪蛋白平板检测法分离筛选获得产蛋白酶芽孢杆菌,对该菌进行形态学和分子生物学鉴定并分析其生长规律、产酶规律以及所产蛋白酶的酶学特性。结果表明,经形态学和分子生物学鉴定该菌为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis),其所产蛋白酶的最适反应条件为50℃,pH=8.0,具有一定的高温耐受性,在弱酸、中性和弱碱性条件下表现出一定的稳定性,Ca²⁺和Mn²⁺能够显著提高酶活(P<0.05),Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺和EDTA、尿素溶液对蛋白酶活力具有显著抑制作用(P<0.05),培养至16 h菌体量达到最大值,发酵22 h上清液中的蛋白酶活力达到最高值(57.77 U/mL)。该芽孢杆菌的成功筛选分离以及其所产蛋白酶的分析研究,为新型饲料添加剂的开发利用提供了物质基础。     

芽孢杆菌和嗜热链球菌相互作用机理的研究

对芽孢杆菌与嗜热链球菌的相互作用机理进行了初步研究,结果表明:混合培养时嗜热链球菌的生物量和产酸量均显著高于单独培养,芽孢杆菌活菌数是先上升后下降的趋势.芽孢杆菌代谢产生的的蛋白酶水解乳中蛋白质产生的寡肽和氨基酸是促进嗜热链球菌生长的主要因素.芽孢杆菌与嗜热链球菌之间是偏利关系,可以利用这种关系进行新型快速发酵乳的研制.     

产纤维素酶芽孢杆菌的诱变和酶学性质研究

为提高芽孢杆菌产纤维素酶的活性,以实验室保存的产纤维素酶枯草芽孢杆菌作为出发菌株,利用紫外线对其进行诱变处理,采用刚果红染色法初筛和3,5-二硝基水杨酸法进行复筛,并对其酶学性质进行初步研究.结果表明:诱变后突变株的纤维素酶活力较出发菌株提高4.476倍.该纤维素酶的最适pH为6.0,且在pH 5.0～7.0酶活力较稳定;该酶的最适酶促反应温度为60 ℃,在无底物保护且水浴30 min的条件下,酶活力在30～65 ℃保持稳定;此外,金属离子K+和Ba2+对酶活力有激活作用,相对酶活分别为108.11％和105.43％,而金属离子Ca2+和Cu2+对酶活性有抑制作用,二者的相对酶活分别为93.80％和89.08 ％.     

短小芽孢杆菌B-15产酶条件的优化及酶学性质的研究

从本实验室分离短小芽孢杆菌B-15能降解羽毛角蛋白生产角蛋白酶,本试验对该菌株的产酶条件进行了优化.结果表明,在羽毛发酵培养基中,B-15产酶的最佳辅助碳源为葡萄糖.最佳辅助氮源为酵母粉,最佳接种量为2%,培养基最佳初始pH值为7.0,产酶最佳温度为30℃,最佳培养时问为48 h.在以上条件下培养,角蛋白酶活力可达2.03 U/mL,是优化前的2.5倍.对B-15所产的角蛋白酶进行了粗酶酶学性质的初步研究,结果表明.该酶最佳反应温度为55℃;最佳反应pH值为7.0;pH 5.5～8.0时酶活力较稳定,可达最大酶活力的70%以上.Mg2 对酶有激活作用,Fe3 对酶有抑制作用.羽毛被降解后,其残渣和发酵后的液体可以作为动物的蛋白饲料.     

芽孢杆菌中性植酸酶基因的原核表达及酶学性质分析

植酸酶作为饲料添加剂能够有效提高动物对饲料中磷的利用率及减少粪便中磷排放对环境的污染,并降低植酸的抗营养作用。为了获得性能稳定的高活性植酸酶,采用PCR扩增芽孢杆菌(Bacillus sp.)中性植酸酶基因phyC(GenBank登录号:FJ986327)的成熟肽编码序列,将其克隆进原核表达载体pET-28a(+),并转化E.coli BL21(DE3)进行表达。在37℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导4 h能够获得大量包涵体蛋白,在25℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h有利于可溶性蛋白的获得。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组植酸酶产物,获得的中性植酸酶的部分酶学特性为:耐热性较好,最适反应温度55℃,在70℃处理10 min可保持20%以上的酶活性;耐酸、碱能力较强,最适pH 6.0～7.0,pH 5.5～9.0时能保持80%以上的酶活性,pH 5.0～10.0时处理60 min仍能保持70%以上的酶活性,在pH 2.0～4.0时能保持40%以上的酶活性。利用构建的切除芽孢杆菌中性植酸酶基因phyC信号肽编码序列的原核表达载体及优化的诱导表达条件,能够在大肠杆菌中高量表达性能稳定的芽孢杆菌中性植酸酶。     

蜡样芽孢杆菌W-3木聚糖酶xynA基因原核表达及其酶学性质研究

【目的】克隆蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)W-3菌株的木聚糖酶基因xynA并进行生物信息学分析,探究其异源表达及酶学特性。【方法】采用同源扩增法克隆xynA基因,构建原核表达载体pCola-xynA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行异源表达,通过镍柱亲和层析分离纯化并通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白,利用在线软件对xynA蛋白进行生物信息学分析。以榉木木聚糖为底物探究xynA在不同温度、不同pH条件下的酶学性质。【结果】xynA基因全长642 bp,含1个完整的开放阅读框,编码213个氨基酸。序列比对结果显示,xynA和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)亚种FZB42木聚糖酶(AJD80562.1)相似性为96%,和类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)NBRC15307木聚糖酶(AAZ17386.1)及高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)同家族木聚糖酶(WP-007407578.1)相似性为94%。xynA蛋白N-端含1个信号肽,理论等电点为9.42,分子质量为23.3 ku,蛋白结...     

一株高产内切纤维素酶贝莱斯芽孢杆菌的产酶条件优化及酶学性质分析

试验旨在对一株杜仲树皮内生菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的内切纤维素酶(CMCase)进行产酶条件优化及酶学性质分析,为探究贝莱斯芽孢杆菌CMCase的相关特性提供参考依据。采用单因子试验设计,分别优化pH、接种量、温度、时间、碳源和氮源等发酵条件,并探讨温度、pH、底物专一性、金属离子及表面活性剂对CMCase的影响。结果表明,以玉米秸秆为碳源(30 g/L)、豆粕为氮源(30 g/L)、3%接菌量、pH 7.0的条件下37℃培养48 h,贝莱斯芽孢杆菌157的CMCase最高可达(5.14±0.18) U/mL。经CMCase酶学性质分析发现,贝莱斯芽孢杆菌157的最适酶反应温度为60℃,最适pH为5.0;温度稳定性试验发现,在40和50℃时,相对剩余酶活力均高于80%,随着温度的升高,酶活力逐渐降低,当温度高于55℃,相对剩余酶活力约为50%;pH稳定性试验发现,在pH 5.0～10.0之间耐受性良好,相对剩余酶活力均高于90%,随作用时间的延长,相对剩余酶活力变化不大。贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase属于典型内切型纤维素酶。Na^+、Mg²⁺、Ca²⁺可促进贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase酶活力,而Co²⁺、Hg²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺和SDS抑制CMCase酶活力;表面活性剂Tween-80、Tween-20、Triton X-100对贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase无影响。本试验通过对贝莱斯芽孢杆菌157进行产酶条件优化及CMCase酶学性质分析发现,贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase具有产酶量高,耐受pH范围广的特点,在饲料添加剂、洗涤剂和造纸领域中具有一定的应用价值。     

蛋白酶和淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质分析研究

从牛瘤胃液中筛选出一株性状优良、产蛋白酶和淀粉酶活力较高的菌株,经初步鉴定为枯草芽孢杆菌。结果表明:该菌株产蛋白酶和淀粉酶的最适时间分别在培养的48h和96h,蛋白酶和淀粉酶的最高酶活力分别为221.57U/mL和54.06U/mL,最适温度分别为40～50℃和20～50℃,最适范围pH在6.0～7.0和pH6.0～8.0。     

枯草芽孢杆菌XY1905木聚糖酶酶学性质的初步研究

对从土壤中筛选到的一株枯草芽孢杆菌XY1905木聚糖酶的酶学性质进行了初步研究,结果表明:木聚糖酶测定的最佳条件是pH为6,反应时间10min,反应温度60℃;热稳定性很强,在80℃下保温1h,剩余酶活96.44%;对金属离子不敏感。     

引起牛奶腐败的嗜热芽孢杆菌的检测及对牛奶酸败速度的影响

取市面上销售的纯牛奶,高温煮沸后在LB培养基划线进行细菌分离培养,结果在LB培养基上形成的菌落大多为形状不规则的突起物,为半透明的奶油色,干燥,表面成薄片状的水泡样菌落,镜检为革兰氏阳性杆菌,初步推测其为枯草芽孢杆菌.本试验还对不同稀释浓度煮沸牛乳对高压灭菌牛乳造成的腐败进行测定,结果显示37℃36小时即可引起牛乳变质.     

猪肠道中产蛋白酶解淀粉芽孢杆菌的筛选、鉴定及其酶学性质的初步研究

试验从健康猪肠道中筛选得到一株高产蛋白酶的芽孢杆菌MY-6菌株,通过形态学观察、生理生化试验和糖醇发酵试验、16S rDNA序列扩增与比对、Biolog鉴定等方法鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。并研究了蛋白酶活力与细菌生活周期的动态关系,pH、温度、金属离子和蛋白酶抑制剂对蛋白酶活力的影响及蛋白酶对不同底物的水解性能。结果显示,MY-6菌株蛋白酶的合成与其芽孢形成同步,均开始于对数生长期的前期,该菌株所产蛋白酶的最适作用条件为：40℃、pH 7.0,Ca²⁺和Mn²⁺对蛋白酶活力有明显的促进作用,PMSF能够完全抑制该蛋白酶的活力,说明该蛋白酶属丝氨酸蛋白酶,蛋白酶对鱼粉蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、酪蛋白的酶解物TCA可溶性肽含量分别为0.83、0.67、0.58和0.38 μmol/g。结果提示,解淀粉芽孢杆菌MY-6菌株可作为改善蛋白质消化的益生性芽孢杆菌的初步选择。     

贝莱斯芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因的克隆、表达及其酶学性质分析

本实验利用PCR方法扩增1株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)源的内切葡聚糖酶基因(CMCase),插入到p ET32a(+)中构建重组表达大肠杆菌系统,对重组内切葡聚糖酶基因进行生物信息学分析以及酶学性质研究。结果表明:内切葡聚糖酶由499个氨基酸组成,预测分子量为55.02 ku,最大开放阅读框ORF约为1 500 bp。经诱导表达优化后,培养上清中可检测到内切葡聚糖酶酶活力为5.81 IU/mL,菌体中为1.61 IU/mL,诱导后原菌液直接超声破碎处理可达7.41 IU/mL,其酶活力为野生菌株的2.3倍。重组内切葡聚糖酶具有典型内切纤维素酶的特征,其最适酶反应温度和pH分别为50℃和6,在60℃条件下放置1 h相对剩余酶活力可保持在70%以上,在pH 6～10范围内可保持90%以上。Na~+、Mg~(2+)可以促进重组内切葡聚糖酶酶活力,而Co~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(2+)等金属离子以及表面活性剂SDS则具有较强的抑制作用。由此可见,本实验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了内切葡聚糖酶,且该酶主要进行分泌表达,具有一定的耐热性和良好的pH稳定性。     

2个枯草芽孢杆菌源纤维素酶基因的克隆、融合表达及其酶学性质分析

本试验旨在构建不同纤维素酶的融合表达系统及探讨融合纤维素酶的酶学性质。利用PCR技术从实验室前期分离的枯草芽孢杆菌中分别扩增2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,设计一段柔性接头(GSGGGS),通过酶切连接将2个纤维素酶基因构建在一个开放阅读框(ORF)内,插入到pET32a(+)中构建重组表达载体pET32a(+)-Cel42-Cel22,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并对其酶学性质进行研究。结果表明:本试验成功克隆了2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,并构建了重组表达系统BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)估计其分子质量约为101 ku,粗酶液中葡聚糖内切酶活性为57.62 U/mL,葡聚糖外切酶活性为32.57 U/mL。试验所得融合纤维素酶Cel42-Cel22的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0,温度在30~70℃范围内时可维持70%以上的纤维素酶活性,pH在4.0~9.0范围内时可保持75%以上的纤维素酶活性,除Mn~(2+)外的其他金属离子对纤维素酶的活性均具有一定的抑制作用,其中Hg~(2+)和Cu~(2+)对的抑制作用较明显。由此可见,本试验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22,且该酶具有一定的活性,可适应较宽广的温度和pH范围,对金属离子敏感。     

一株产淀粉酶、蛋白酶益生芽孢杆菌的分离与鉴定

本试验根据芽孢杆菌生理特点,采取稀释平板法从健康日本鹌鹑(Coturnix japonica)盲肠内容物中分离获得一株芽孢杆菌P-12,结合细菌生理生化鉴定、16S rDNA测序和系统发育树对其进行分析。研究表明,该菌种为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),其16S rDNA GeneBank登录号为GU269268,具有产蛋白酶、淀粉酶活性。     

产果胶酶枯草芽孢杆菌的鉴定、发酵条件优化及产物酶学性质的研究

以果胶为唯一碳源筛选到1株产果胶酶的菌株JLSP-13,通过菌落形态观察、生理生化指标试验和16SrDNA保守序列分析,鉴定JLSP-13为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis JLSP-13。采用响应面法(RSM)优化其产酶条件,并系统研究产物酶学性质。结果表明:B.subtilis JLSP-13的最佳发酵时间为25.02 h,添加可溶性淀粉和果胶的最佳浓度分为0.61%和0.042%,B.subtilis JLSP-13果胶酶(BpgA)活性最大预测值达38.8 U/mL,验证值为37.6 U/mL,是基础培养基的2.6倍。BpgA的最适温度为60℃,Tm为82.9℃,其热稳定性较好;最适pH为6.0,在pH 6.0～8.0范围内较稳定;Km和Vmax分别为5.128 mg/mL、12.92 mg(/mL.min),BpgA能快速降低果胶底物的黏度。     

两株益生芽孢杆菌的安全性及酶学性质研究

试验旨在研究两株芽孢杆菌的安全性及产酶特性。对两株芽孢杆菌进行了急性毒性试验、慢性毒性试验、细菌易位试验、有害代谢产物检测、溶血试验、产酶性能定性和产淀粉酶、蛋白酶的定量试验。结果显示：两株芽孢杆菌的安全性良好,无急性毒性、慢性毒性,不会对组织器官产生损害、不易位、不产生有害代谢产物、不溶血。解淀粉芽孢杆菌SSYB株的产淀粉酶能力高于枯草芽孢杆菌LLYB株,但LLYB株的产木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶能力均优于SSYB株,两株芽孢杆菌均无产植酸酶和脂肪酶的能力。SSYB株的产蛋白酶活力为16.6 U/mL,产淀粉酶活力为1.79 U/mL,LLYB株的产蛋白酶活力为50 U/mL,产淀粉酶活力为1.6 U/mL,与定性测定时两株菌产酶趋势一致。研究表明,两株芽孢杆菌的安全性良好,具有产多种生物酶的能力,在饲料添加剂研发方面具有一定的应用前景。     

鹰嘴桃中1株解蛋白芽孢杆菌的鉴定及酶学特性研究

试验对鹰嘴桃中分离的菌株C进行鉴定及酶学特性研究。对菌株C进行菌落形态观察、革兰氏染色、生化鉴定和16S rDNA序列测定,以酪蛋白为底物培养菌株C,采用滤纸片法进行酶解圈试验,采用福林酚法定量测定菌株C产生的蛋白酶活力,探究pH值、反应温度、金属离子对酶活力的影响和酶的热稳定性。结果显示,菌株C为解蛋白芽孢杆菌,具有酶解酪蛋白的能力,产蛋白酶的活力为13.40 U/m L。该菌株所产蛋白酶的最适反应条件为pH值7.0,最适反应温度为30℃,属于中性、低温蛋白酶,80℃水浴中保持30 min后仍保持97%以上的相对酶活,具有良好抗热性,Cu^(2+)对该蛋白酶的抑制效果最为明显,其次是Fe^(2+)。研究表明,鹰嘴桃中分离的解蛋白芽孢杆菌有在工业中应用的潜力。     

一株产高温纤维素酶菌株的筛选、鉴定及其酶学性质研究

从云南大理市弥渡县石夹泉热泉的55℃底泥中筛选到1株高温纤维素酶的高产菌株,对其进行显微形态及生理生化特征、16SrRNA基因序列分析,将其初步鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的一株菌,命名为Acinetobacter sp.Cel-55。对其生长条件及酶学性质进行研究,结果表明:该菌株耐高温性较好,菌株在55℃仍能生长,菌株最适生长温度为37℃。所产纤维素酶最适酶活温度为75℃,最适反应pH为7.0。该酶具有良好的热稳定性,在75℃下,保温120min仍能保持80%的活性。Zn^2+、Mn^2+、Ca^2+、K^+、Mg^2+、Fe^2+、Cu^2+均对酶活力起一定的抑制作用,其中Mg2+的抑制效果最为明显。