广西巴马小型猪MyoG基因克隆及外显子3多态性分析

为了解RT-PCR扩增广西巴马小型猪肌细胞生成素(MyoG)cDNA序列,并分析与其他物种间的聚类关系,试验采用PCR-SSCP技术分析广西巴马小型猪、长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因外显子3多态性,根据GenBank中已发表的猪MyoG基因序列设计PCR引物,以广西巴马小型猪肌肉组织总RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;从4个猪种的耳组织中分别提取30个个体的基因组DNA,采用PCR的方法扩增出外显子3并进行SSCP分析。结果表明:克隆得到广西巴马小型猪MyoG基因编码区长675 bp,与四川野猪、人、奶牛、小鼠同源序列相似性分别为99.7%、93.8%、91.7%、90.5%,且不同物种间保守性较强;与四川野猪相比,克隆得到的广西巴马小型猪MyoG cDNA序列在第233位点及第642位点上发生基因突变;广西巴马小型猪MyoG基因的基因型只有AA型,而长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因的基因型只有AB型,各群体内无多态性。     

巴马小型猪主要细胞因子的克隆及序列分析

为了丰富广西巴马小型猪细胞因子生物学数据,本试验采取广西巴马小型猪的外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR扩增,将克隆出的与目的基因大小相符的片段回收,再与T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后提交NCBI,比较克隆序列与已知序列的同源性,并利用软件对克隆序列进行分析。结果表明,已克隆出的巴马小型猪细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α基因序列长度分别为338、377、380、402 bp,测序结果均与目的基因预期估计值吻合。序列分析结果发现与已知的家猪或野猪的相应基因同源性较高,IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α序列同源性分别为98.9%、99.5%、99.2%、100%。研究巴马小型猪细胞因子基因序列不仅丰富了生物学数据,而且为细胞因子的功能研究提供了依据,也为细胞因子的定量检测奠定了基础。     

鸭脂联素基因全长cDNA的克隆和原核表达的研究

本研究旨在通过克隆鸭脂联素(Adiponectin)基因序列并进行序列分析,揭示该基因的序列特征、组织特异性表达规律,并对其进行原核表达。采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE的方法从鸭脂肪组织总RNA中扩增脂联素基因cDNA片段;半定量RT-PCR检测组织表达特异性;构建原核表达载体,建立原核表达体系。从鸭脂肪组织中得到3个脂联素基因cDNA片段,克隆测序后,拼接获得了鸭脂联素基因1374bp全长cDNA序列,其包含一个长度为738bp完整的开放阅读框,编码245个氨基酸;编码区与鹅、鸡脂联素基因序列的同源性分别为94.9%和86.0%,与人、小鼠、狗等物种脂联素基因的同源性在64.2%～67.0%之间;氨基酸序列比较可知,鸭与鹅、鸡的脂联素氨基酸的同源性分别达95.5%和84.0%,与人、小鼠、狗等哺乳动物的同源性在65%左右。半定量RT-PCR研究结果表明脂联素基因在所测组织中均表达,且高度表达于脂肪组织、肌胃、小肠、心和骨骼肌,中度表达于肺、腺胃、卵巢和脾组织中,而在肝、肾和间脑中低度表达。构建得到在其C端含有8个组氨酸的鸭脂联素融合蛋白表达载体pET41a-duck-adp,重组表达质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌中表达,经IPTG诱导后并SDS-PAGE检测获得了30ku的鸭脂联素原核表达蛋白。脂联素基因在动物进化中具有一定的保守性,该基因在不同组织中表达水平不同,通过原核表达可获得鸭脂联素的重组蛋白。     

广西巴马小型猪卵泡抑素的克隆及原核表达

从广西大学巴马小型猪卵巢中提取总RNA，并以其为模板，应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），在合成的特异性引物引导下，扩增获得广西巴马小型猪卵泡抑素（follistatin）cDNA的全序列，长度为1035 bp。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：广西巴马小型猪卵泡抑素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99.4%。同时，将目的基因插入到原核表达载体pET 32a+多克隆位点中，构建了follistatin的原核表达载体，并转化于大肠杆菌BL21。转化菌经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析，结果表明：试验已成功表达了follistatin的融合蛋白(约58.4 ku)。     

广西巴马小型猪白细胞抗原经典Ⅱ类基因克隆及生物信息学分析

为探讨广西巴马小型猪SLA经典Ⅱ类基因分子结构特征及其在猪-人异种器官移植研究中的应用前景,本研究采集4头广西巴马小型猪的耳组织,经抽提RNA和反转录得到cDNA,通过PCR扩增,对SLA经典Ⅱ类基因(SLA-DRA、SLA-DRB1、SLA-DQA、SLA-DQB1)纯化和克隆,进行双向测序。结果,在4个SLA经典Ⅱ类座位中得到基因序列共8条,利用NCBI服务器中BLAST分析发现,8条基因序列中5条为已知的等位基因,另3条为新的等位基因。通过核苷酸和氨基酸水平的同源性比对,构建亲缘进化树,分析发现,广西巴马小型猪具有与人同源性较高的MHC遗传结构,显示该猪种在人-猪异种移植领域中有着潜在的利用价值。     

广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建

本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。     

广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建

本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。     

内蒙古绒山羊褪黑激素受体1a基因外显子1 克隆及序列分析

参考GenBank上已发表的绵羊(登录号:15U14109)、人(登录号:U14108)、牛(登录号:U73327)、鼠(登录号:U52222)等物种褪黑激素受体(melatonin receptor 1a,MTNR1a)基因 cDNA序列设计引物,以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到257 bp的基因片段,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较。结果表明,绒山羊MNTR1a基因外显子1序列与已发表的绵羊和牛该基因序列同源性分别为99%和96%,说明所得到的序列为绒山羊MNTR1a基因的外显子1序列。利用DNAStar软件分析,得到该基因序列的257个核苷酸。该序列包括5''UTR 23个核苷酸、翻译起始密码子ATG和N端78个氨基酸编码序列。     

广西巴马小型猪TXNIP基因真核表达载体的构建及鉴定

为了克隆广西巴马小型猪硫氧还蛋白相互作用蛋白基因(TXNIP)序列并构建真核表达载体,为生产转TXNIP基因的广西巴马小型猪奠定基础,试验采用RT-PCR技术从广西巴马小型猪胰腺组织中扩增出TXNIP基因编码序列,连接至p MD18-T载体,测序鉴定后提取质粒,用SalⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切,回收的TXNIP片段连接至p EGFP-C1载体上,构建含TXNIP的真核表达载体p EGFP-C1-TXNIP;利用双酶切和测序对重组质粒p EGFP-C1-TXNIP进行鉴定,并将重组质粒转染β-TC6细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。结果表明:广西巴马小型猪TXNIP基因编码区序列长1 176 bp,编码391个氨基酸,与Gen Bank已公布的猪TXNIP基因c DNA序列(序列号为DQ278874)对应区段同源性为99.7%;重组表达载体p EGFP-C1-TXNIP质粒转染β-TC6细胞能表现出绿色荧光。