生物素标记ST基因探针检测产肠毒素性大肠杆菌的研究

采用二步法缺口翻译反应,用Bio-11-dUTP标记编码大肠杆菌耐热肠毒素的DNA片段作为杂交探针,通过菌落杂交试验,在严格去蛋白和RNA的条件下,表明生物素标记的DNA探针对产肠毒素性大肠杆菌的检测具有高度特异性.用链亲和素和生物素-碱性磷酸酶系统,通过点杂交试验可以检测出1.25pg的靶序列DNA.     

产肠毒素性大肠杆菌耐热性肠基因探针的制备及初步应用

产肠毒素性大肠杆菌重组菌PSLM004质凿经JaqI酶切，其840bp的片段用^82P-dATP标记后作为STI基因探针。菌落原位杂交 表明，该探针可以和人源、猪源产STI的ELEC有阳性杂交反应，而不与不产STI的载体菌株pBR322、非致病性E.coli和勘察肠道 力有杂交反应。用该探针对35株已知血清型的E.coli、65株从人腹泻分离的E.coli.和7株猪腹泻.coli进行STI基因检测，分别有6株、7株和2株STI探针菌落杂交阳性，阳性率分别为17％（6／35）、11％（7／65）和28％（2／7）。乳鼠生物学试验比较研究表明，70％（11／16）的STI探针检测阳性菌株其乳鼠生物学试验也为阳性，用该探针可以对产STI的ETEC者临床检测和流行病不调查。     

用生物素标记DNA探针检测和计数食品中产ST大肠杆菌

将人工污染产ST大肠杆菌的鲜猪肉、鸡蛋和牛乳稀释液接种到铺在LB琼脂表面的硝酸纤维素膜上,经37℃6～10h培养和严格的去蛋白和RNA处理后,用生物素标记的编码大肠杆菌耐热肠毒素的DNA片段作为基因探针,检测了污染食品中的产ST大肠杆菌.本法具有高度特异性,其敏感性为100个细菌/g.     

产肠毒素性大肠杆菌疫苗研究概况

产肠毒素性大肠杆菌（简称ETEC）是引起仔猪腹泻的主要病原之一。在家畜中,尤以初生幼畜特别易感。并引起生长发育迟缓,生产能力低下,甚至造成死亡。给畜牧业造成很大损失。ETEC肠毒素基因和菌毛蛋白（黏附素）基因对于ETEC的致病性起主要作用。除了灭活疫苗、减毒疫苗、结合多糖疫苗和亚单位疫苗外,新近出现的DNA疫苗、转基因植物疫苗为疫苗的研制提供了新的思路。本文概述并评价了各类产肠毒素性大肠杆菌疫苗．并简要介绍了产肠毒素性大肠杆菌疫苗最新的进展。     

产肠毒素性大肠杆菌主要毒力因子的研究进展

产肠毒素性大肠杆菌的毒力因子包 括黏附素,肠毒素,水肿病毒素,内毒素,溶血 素以及EatA。其中黏附素和肠毒素无论是 从发病学还是免疫学角度来讲,都扮演着很 重要的角色。猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏 附素抗原主要有K88(F4),K99(F5),987P (F8)和F41,肠毒素包括耐热肠毒素与不耐 热肠毒素。     

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。     

鸡抗猪产肠毒素性大肠杆菌卵黄抗体的应用

产肠毒素性大肠杆菌与仔猪腹泻的致病过程密切相关。卵黄抗体具有价格便宜、制作简单等优点,能降低腹泻的发生率和严重程度,是防治仔猪大肠杆菌性腹泻的一种新方法。本文就国内外鸡抗猪产肠毒素性大肠杆菌卵黄抗体的应用作了简要介绍。     

猪源肠毒素性大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立

为了对猪源产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）的4种主要菌毛（K88、K99、F41和987p）进行快速检测和分型，建立了检测4种菌毛的多重PCR方法。首先设计合成4对4种菌毛特异性的引物，然后用4种菌毛参考ETEC菌株优化了多重PCR方法。该方法对K88、K99、F41和987p 4种菌毛的扩增产物分别为201，314，380和459bp。对4种扩增产物分别进行酶切鉴定，结果均得到与预期一致的2个片段。对各个参考菌株不同组合的检测结果为100％符合。结果表明，该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于ETEC性腹泻的辅助诊断及ETEC菌毛抗原分型检测。     

喹赛多对仔猪产肠毒素大肠杆菌感染的预防效果

150只去势长大仔猪随机分为6组，Ⅰ和Ⅳ组饲喂不含抗菌药的基础日粮，Ⅱ和Ⅴ组基础日粮中添加喹乙醇100mg／kg，Ⅲ和Ⅵ组基础日粮中添加喹赛多100mg／kg。Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组仔猪灌服10^10CFU产肠毒素性大肠杆菌（O139：K88），Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组仅灌服肉汤。结果表明，喹赛多饲喂猪直肠粪便中大肠杆菌总数和接种的血清型大肠杆菌数与喹乙醇饲喂猪均无显著差异（P〉0．05），喹赛多和喹乙醇饲喂猪直肠粪便中接种的血清型大肠杆菌数均低于非药物饲喂猪（P〈0．05）。Ⅳ组仔猪感染率为68％；Ⅴ和Ⅵ组感染率均为16％。药物饲喂猪平均日增重显著改善（P〈0．05），喹赛多饲喂猪平均日增重高于喹乙醇饲喂猪（P〈0．05）。Ⅳ组仔猪平均日增重和饲料转化率分别下降9．6％和8．4％，Ⅵ组仔猪日增重和饲料转化率分别提高11.9％和7．9％，均高于Ⅴ组（4．2％和1．5％）。可见喹赛多不仅对断奶仔猪产肠毒素大肠杆菌感染有显著预防作用，而且还有较好的促进生长和提高饲料转化率作用。     

产肠毒素大肠杆菌菌毛的DNA疫苗研究进展

肠毒素大肠杆菌是导致婴幼儿及旅游者急性腹泻,仔猪腹泻和水肿的主要病原菌之一。菌毛定居因子是该病原菌主要的致病因素。DNA疫苗既能激发机体的细胞免疫,也能诱导特异性的体液免疫。目前用于预防ETEC腹泻的DNA疫苗的研究已取得一定进展,作者从重组质粒的构建、免疫应答、疫苗的接种系统以及基因佐剂4个方面简单的概述了产肠毒素大肠杆菌菌毛的DNA疫苗的研究现状。     

地高辛标记大肠杆菌1型菌毛结构基因核酸探针对鸡大肠杆菌分离株的检测

将PCR扩增的鸡大肠杆菌 1型菌毛蛋白结构基因 (pilA)用地高辛标记成核酸探针与分属 2 8个血清型的 50个鸡大肠杆菌分离株进行斑点杂交 ,阳性率达 84% ,用甘露糖敏感血凝试验 (MSHA)检测阳性率为 72 % ,表明核酸杂交比MSHA法更敏感。     

猪肠道大肠杆菌噬菌体对产肠毒素大肠杆菌的抑菌作用

此前本实验室从健康猪肠道及粪样中分离纯化得到57株大肠杆菌噬菌体,发现其中有12株噬菌体可裂解产肠毒素大肠杆菌（ETEC）,本研究旨在探究这些大肠杆菌噬菌体的宿主谱及抑菌效力,以期了解肠道内大肠杆菌噬菌体对机体的保护作用。以89株大肠杆菌为宿主菌（其中包括5株ETEC）,采用点滴法、双层平板法和液体扩增法测定噬菌体的宿主谱,利用浊度法测定噬菌体对ETEC的抑菌效力,并对噬菌体分类进行鉴定。12株噬菌体均能裂解一种或多种ETEC,但是均无法通过感染ETEC而增殖。S143_1、S143_2、S144_2、S35、S86_1、L86及S172等7株噬菌体虽然无法通过ETEC产生子代噬菌体,但在感染复数（MOI）为10或100时仍对ETEC具有显著的抑菌效力。12株噬菌体中有8株为T4样噬菌体,其他4株噬菌体均属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。本研究从猪肠道内分离到12株大肠杆菌噬菌体,虽然无法感染ETEC,但仍可裂解ETEC,其中,7株在MOI为10或100时可有效地抑制ETEC生长。     

产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立

为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314 bp;最终确定dNTP终浓度0.4 mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25 μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。     

用地高辛标记的核酸探针检测猪伪狂犬病毒野毒感染的研究

利用PCR技术从带有伪狂犬病毒（PRV）gE基因的重组质粒pMD18-T-gE中扩增回收约304bp大小的片段,并制备出地高辛标记的gE基因核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与重组质粒DNA发生特异性杂交,而与对照的PRVBartha-k61株疫苗毒DNA、猪细小病毒（PPV）DNA、猪圆环病毒（PCV）DNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRsV）cDNA、猪瘟病毒（CSFV）cDNA的杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对PRV野毒的最低检出量为4pg。应用该探针对11份繁殖障碍病料进行了杂交检测,共检出4份阳性病料,该结果与PCR检测结果一致,表明该核酸探针可用于猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断。     

耐氟喹诺酮类药物禽源大肠埃希菌gyrA基因的检测分析

探讨不同禽源大肠埃希菌中喹诺酮类药物的耐药情况及耐药基因gyrA的分布和突变特征。采用K-B药敏纸片法、gyrA基因的PCR扩增,对9株大肠埃希菌进行喹诺酮类药物试验,并将gyrA基因的PCR产物测序,对测序结果采用DNA MAN、DNA Star、MEGA6等软件分析。药敏试验结果表明,C1、C2、C3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星敏感,D1、D2、D3、B1、B2和B3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星均表现为耐药和中介;gyrA基因的测序结果表明,除B1菌株有1处核苷酸突变位点和B2菌株有14处核苷酸突变位点;B2菌株gyrA基因的氨基酸突变发生在87位Ile→Val替代、101位Leu→Met替代、102位Ala→Ser替代、129位Lys→Gln替代。9株禽源大肠埃希菌的同源性和进化树分析表明,不同禽源耐氟喹诺酮类药物的大肠埃希菌菌株中B2菌株gyrA基因与其他9株菌株相比,同源性在90%左右,进化树不在一个分支上,研究中的B2菌株将为大肠埃希菌的氟喹诺酮类耐药机制的研究提供候选菌株。