鸭产蛋量相关遗传变异和功能基因筛选及鉴定

【目的】通过高通量混池重测序和选择清除分析比较鸭不同产蛋量组间基因组显著差异区域内的SNP和基因差异,以筛选和鉴定出鸭产蛋量相关的遗传变异位点和功能基因,为通过分子遗传育种手段提高鸭产蛋性能提供依据。【方法】根据金定鸭群体开产后150 d内个体产蛋量情况,选择2种极端表型,分为高产蛋组(CH)和低产蛋组(CL)。基于混池全基因组重测序和选择清除分析技术筛选不同鸭产蛋量组间基因组显著差异区域内的SNP及相关功能基因,通过单个样本PCR扩增子测序对筛选的产蛋量相关SNP进行验证,对筛选的候选基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,确定候选基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径,并分析不同基因型间产蛋量高低差异。【结果】在低产蛋量组和高产蛋量组分别获得192 071 438和229 836 820条的clean reads,共定位到的SNP差异极显著区间为1 368个,受选择候选基因为214个,而且这些区间和基因主要位于Z号染色体,主要包括KDM4C、LURAP1L、PTCH1、PRUNE2、TRPM3和VPS13AD等基因。验证结果表明重测序结果准确。GO功能分析表明,受选择基因在分子...     

云南地区马流感病毒检测及其HA基因序列分析

马流感能引起马属动物的高度接触性呼吸道传染病。该病毒已知仅存在H7N7(马流感病毒1型)、H3N8(马流感病毒2型)两个亚型,目前仅H3N8亚型毒株在全球范围内引起马流感流行和暴发。采用A型及H3亚型特异性RT-PCR技术,检测云南疑似马流感病例鼻腔棉拭子样品;HA基因PCR扩增产物经纯化后,克隆至pMD18-T载体进行测序,并与已知代表性毒株对应序列进行比对及系统发育分析。研究发现云南马流感病毒与已知代表毒株血凝素基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别介于91.2%~99.2%和89.5%~98.4%,属于美洲谱系(American lineage)佛罗里达亚谱系(Florida sub-lineage)毒株。     

马流感病毒A/马/青海1/94株亚型鉴定及其HA基因序列特征

本试验用AI标准阳性分型血清对我国马流感病毒A／马/青海/1／94进行了血凝素(H)和神经氨酸酶(N)的鉴定，并与马流感病毒吉林株、黑龙江株、北京株及国际标准株A／切ukx／Mgxd／2／63进行了对比，结果显示，1944年在我国青海省暴发的马流感病毒的亚型为H3N8；以反转录。聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增该株的血凝素基因，并克隆到pGEM-Teasy载体上，采用双脱氧末端终止法测定该cDNA片段共1738个核苷酸序列，并推导出其编码的565个氨基酸的序列。利用Genbank blast和基因进化树分析软件分析各毒株之间的亲缘关系，发现A／马/青海/1/94与1992年香港马流感分离株存在较近的亲缘关系。     

流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增了禽流感病毒Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）１．７ｋｂ的ＨＡ基因,将其克隆到ｐＵＣ１９的ＢａｍＨＩ位点,筛选到阳性重组子 ｐＵＣＨ５。然后将 ＨＡ基因亚克隆到杆状病毒转移载体 ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ,筛选到重组转移载体ｐＢａｃＨ５。经过序列分析证明阅读框架正确后,在脂质体转染试剂介导下,ｐＢａｃＨ５与线性化的杆状病毒 ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅ ＤＮＡ）共转染Ｓｆ９昆虫细胞。重组杆状病毒经三轮蚀斑纯化,获得纯化的重组杆状病毒ｒＢａｃＨ５。提取重组杆状病毒ＤＮＡ经ＰＣＲ扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、血凝试验和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验结果表明 ＨＡ基因在重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞表面获得表达。重组杆状病毒表达的ＨＡ蛋白能够凝集公鸡红细胞,血凝价１２８０－２５６０ＨＡＵ／ｍｌ。ＨＡ蛋白在杆状病毒表达系统的成功表达,为禽流感亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

流感病毒 HA 受体结合位点抑制剂研究进展

目前临床所用控制流感病毒的药物和疫苗受到病毒耐药性、疫苗滞后性等诸多因素的限制,使能阻止病毒侵入宿主细胞的抑制剂成为当前研究的热点。唾液酸是流感病毒囊膜表面血凝素（HA）的受体,但研究表明唾液酸并不适合作为研制流感病毒侵入宿主细胞抑制剂的结构模型。研究发现流感病毒的HA 受体结合位点必须外露才能与宿主细胞受体结合,因此 HA 受体结合位点可以被宿主免疫系统监视,成为抗体潜在的靶向契合位点。随后发现的 HA 受体结合位点抗体能与 HA 受体结合位点的保守氨基酸残基结合,能有效阻止流感病毒感染宿主。因此,可用 HA 受体结合位点抗体作为流感病毒感染抑制剂的模型,研制流感病毒抑制剂。论文就流感病毒 HA 的分子结构和功能,HA 结合受体的机制,HA 受体结合位点抗体以及该类抗体对流感病毒的抑制效果进行了阐述,以期对以 HA 受体结合位点抗体为模型研制流感病毒感染抑制剂提供帮助。     

H3亚型鸭源流感病毒分离鉴定及HA基因序列分析

为了研究H3亚型禽流感病毒的分子特征,本研究从鸭的粪便样本中分离到一株禽流感病毒,通过血凝抑制试验证实该分离株为H3亚型流感病毒,命名为A/Duck/Heilongjiang/1/2014(H3N2).对其血凝素基因进行了克隆和序列分析,结果表明分离株与韩国水鸟的H3N2亚型AIV A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005的同源性最高,达到94.6％.系统发育树分析进一步证实分离株可能来源于韩国的水鸟.本研究为H3亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据.     

马流感A/马/京防/74-1(H7N7)毒株HA基因的序列分析

流感病毒(Influenza Virus)根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种表面抗原蛋白分为不同的亚型,马流感I型(H7N7)和Ⅱ型(H3N8)是其中比较重要的两个亚型.本研究应用无特定病原体(SPF)鸡胚增殖马流感病毒A/马/京防/74-1(H7N7)毒株,TRIzol LS Reagent提取病毒RNA,RT-PCR扩增HA基因全片段,克隆到PMD18-T载体上,并进行了鉴定和序列测定.所获得的HA基因片段长1 727 bp,编码563个氨基酸残基.根据推导的氨基酸序列进行预测,有7个潜在的糖基化位点和16个半胱氨酸残基,通过序列分析推断,A/马/京防/74-1(H7N7)株病毒的HA来源于禽类,是一株通过基因重排出现的重组病毒.     

新型重配甲型H7N9流感病毒HA基因序列分析

为了分析2013年新型重配甲型H7N9流感病毒HA基因分子流行病学特征,从NCBI数据库下载不同分离宿主的流感毒株HA全基因序列,应用分子生物学软件进行遗传演化分析。结果显示:A/Hangzhou/1/2013(H7N9)株HA裂解位点为PEIPKGR↓GLF,含有2个碱性氨基酸;HA蛋白有糖基化位点5个。抗原位点和受体结合位点,相对于之前人感染的H7亚型流感病毒发生不同程度变化。与A/Hangzhou/1/2013(H7N9)株中HA片段的核苷酸同源率较高的前10个毒株均分离自亚洲国家禽类,同源率达到95%以上。此次新型重配H7N9流感毒株HA基因是否由禽传给人有待进一步研究。     

种群遗传变异及基因多样度分析

阐述了种群遗传学和生态遗传学研究的基本单位－种群的定义和意念含义,其一是种系变异含义,其二是生态适应含义,并概述了遗传变异的研究历史。从３个方面及质量性状变异,数量性状变异与基金变异,介绍了种群遗传变异的研究方法,重点介绍了基因变异的测量和亚种群基因多样度的测量,并且依据研究所得的遗传参数对中国苜蓿不同种群遗传结构和多样度进行了例证分析。     

猪红细胞生成素受体基因遗传变异分析

根据GenBank中登录的猪红细胞生成素受体（erythropoictin receptor,EPOR）基因mRNA序列（登录号：AF274305）和其基因组序列（登录号：EU407778）设计8对引物,以10头北京黑猪和10头大白猪DNA混合池为模板,采用测序的方法研究猪EPOR全基因序列的遗传变异。研究结果发现,EPOR基因长约5.2 kb,含有1个5′UTR、8个外显子、7个内含子及1个3′UTR。经混合DNA池测序,共在内含子区发现9个SNP位点：g.705G＞T位于内含子1;g.1450C＞T 位于内含子2;g.2373C＞T 位于内含子4;g.2882C＞T、g.3035A＞G、g.3132A＞T、g.3295C＞T、g.3942C＞T、g.4106G＞A位于内含子6,为进一步研究EPOR基因与产仔性状的关联奠定了基础。     

南京市首例甲型H1N1(2009)流感病毒分离及其血凝素基因遗传变异分析

对南京市首例甲型H1N1(2009)病毒进行细胞分离,获得一株具有较高血凝活性的病毒,命名为A/Nanjing/1/2009。在全基因组测序的基础上,对分离株的血凝素基因(haemagglutinin,HA)的遗传特征进行了详细研究。分离株HA蛋白不具有多碱基HA裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与参考株A/California/04/2009相比,分离株A/Nanjing/1/2009HA蛋白的有5个氨基酸发生了突变,其中一个位于Ca抗原位点208位氨基酸(R→K),这一突变虽然还不会影响抗原性的改变,但预示了新甲型H1N1(2009)抗原漂移的启动。分离株有5个潜在糖基化位点,这与近年来古典猪H1N1和北美三源重配猪H1病毒完全一致,保留了古典猪H1病毒的特点。与禽H1病毒相比,分离株HA蛋白受体结合位点上的190(E→D)和225(G→D)位点发生突变,这可能成为新甲型H1N1(2009)在人际间传播的一个重要分子基础。此外,其它受体结合位点上相关氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。本研究对南京市早期流行的甲型H1N1(2009)流感病毒的HA蛋白的分子遗传特征进行了详细研究,对进一步监测病原变异具有重要指导意义。     

H5亚型鸭源流感病毒HA基因序列生物信息学分析

A型流感病毒（AIV）引起的禽类禽流行性感冒（avian influenza,AI）或相关疾病,被国际兽疫局定为甲类传染病。AIV中最容易突变的基因是血凝素（HA）基因,具有亚型和株的特异性,是区分病毒亚型的依据之一。本研究从GenBank中下载了所有209条鸭源H5禽流感病毒HA基因的全序列,利用生物信息学软件构建进化树研究序列的聚类特点;比较不同年份毒株的HA基因的受体结合位点氨基酸,找出受体结合位点氨基酸的变异规律;比较不同年份分离的鸭源H5N1序列的HA1和HA2蛋白的剪切位点,找出各年份毒株的剪切位点的特点;比较不同年份分离序列的潜在糖基化位点,统计各年份潜在糖基化位点的数量以及序列变化。期望找到H5亚型鸭源流感病毒的变异规律和变异方向,为鸭源流感的防控起到积极的作用。     

一株鸭源新城疫病毒毒力基因分析及其对鸭的致病性研究

为了解中国鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的毒力特点,从2009年广东地区发病鸭群中分离和鉴定出1株新城疫病毒(简称NDV-104),对其生物学特性、致病性和融合蛋白(fusion,F)、血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因进行了研究。结果显示,分离株的MDT、ICPI和IVPI分别为56.4 h、1.95和1.64,结合F蛋白裂解位点(112~117位)的氨基酸序列分析,确定了分离株为新城疫强毒。致病性结果表明,分离病毒对雏鸭具有感染性和致病性。F基因遗传进化结果显示,分离株属于基因Ⅶd亚型。F、HN蛋白的氨基酸同源性结果表明,分离株与2000年以来国内外分离到的基因Ⅶ型NDV同源性较高,分别为96.6%~99.3%和97.0%~99.7%,而其与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和LaSota的F、HN蛋白氨基酸序列的同源性较低,且与LaSota株和V4株的同源性最低,分别仅为88.1%和87.6%,说明分离株与经典新城疫病毒毒株存在一定的差异。     

H6亚型鸭源流感病毒HA基因序列分析

为了研究H6亚型禽流感病毒的分子特征,本研究从鸭的咽喉拭子样本中分离到一株禽流感病毒,通过血凝抑制试验证实该分离株为H6亚型流感病毒,命名为A/duck/Heilongjiang/QG 1/2013(H6).对其血凝素基因进行了克隆和序列分析,结果表明分离株与我国鸭源禽流感病毒A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的同源性最高,达到97.8％.系统发育树分析进一步证实分离株与A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的亲缘关系最近,共同起源于台湾分离株A/chicken/Taiwan/G23/87 (H6N1).本研究为H6亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据.     

犬乙肝病毒S基因遗传变异研究

应用人乙肝诊断试剂盒，对检测出来的“三阳（HBsAg,HBeAg,抗-HBc)犬的乙肝病料进行了病毒分离和形态学鉴定，并以人乙肝病毒S基因两侧的保守区域作为模板，采用PCR方法扩增出犬乙肝病毒部分基因，序列分析结果，其核苷酸序列为1157bp，编码385个氨基酸，遗传变异分析结果表明，在S基因保守区内有27个编码氨基酸与人的不同，其中16个为性质相反或不同的氨基酸置换，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.5%和93.4%，系统发育进化树比较表明二者的遗传关系较远，揭示犬乙肝病毒与人乙型肝炎病毒S基因保守区之间存在很大差异；而与鸡，羊乙肝病毒S基因保守区序列相比较，遗传变异更大。     

一株H9亚型禽流感病毒HA基因的遗传变异分析

对2006年采集的1份禽流感病鸡组织进行RNA抽提后,采用A型流感病毒通用引物进行禽流感病毒HA基因的扩增,并进行T载体克隆及测序,获得了一株H9亚型禽流感病毒的HA序列。序列分析表明,此血凝素基因的ORF由1683个核苷酸组成,编码560个氨基酸,属A／Chicken／Beijing／1／94系。将其在GenBank中Blasl后发现,其与1株珍珠鸡H9N2病毒（A／Guineafowl／Hongkong／NT101／03）和1株鸡H9N2病毒（A／Chicken／Hongkong／AP45／03）的同源性和分值最高,同源性可达97％,较中国2006年前的分离株进化相对稳定,核苷酸的变异不大。切割位点的序列为-PARSSRGLF-,仍属于低致病力毒株。但Gln226Leu的变异,使其成为一种潜在的可感染人的禽源毒株。     

流感病毒与细胞受体相互作用的复杂性

细胞受体是流感病毒感染、复制与传播的生物学基础.病毒血凝素基因的差异和细胞上不同类型的受体是影响病毒受体结合特性的两个重要因素.了解这两个因素有助于人们进一步认识流感的病原学、感染机制、流行病学等内容,对于流感的监测、疫苗研制和公共卫生学都将有借鉴意义.论文就流感病毒基因特点、细胞受体类型差异及二者相互作用的复杂性进行综述.     

H3N2亚型犬流感病毒HA1基因的原核表达及抗原性分析

为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。     

血清Ⅰ型鸭源副粘病毒HN蛋白基因的遗传变异及原核表达

参考GenBank发表的鹅副粘病毒（GPMV）SF02株基因组核苷酸序列，设计并合成了1对特异性引物，采用RT—PCR技术扩增鸭源血清I型禽副粘病毒DP1／0z株的HN基因，并进行遗传变异及原核表达研究。结果显示，HN基因共1716bp，编码571个氨基酸，存在6个潜在的糖基化位点和13个完全保守的半胱氨酸（C）残基。与GenBank中收录的鹕源副粘病毒HN基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为81．3％～98．3％和87．2％～98．4％，系统进化树分析表明DP／02株与鹅源副粘病毒处于同一进化分支。经SDS—PAGE、Western—blot分析，原核表达的HN蛋白相对分子质量在63000左右，1mol／L（终浓度）IPTG时间梯度诱导，3h时HN蛋白表达量最高，占整个菌体蛋白含量的30％，且能与鼠抗鸭源血清I型禽副粘病毒阳性血清反应。     

湖北株H3N8亚型马流感病毒HA基因的序列测定及其HA蛋白遗传特性分析

2008年从湖北省分离到1株H3N8亚型马流感病毒A/equine/Hubei/6/08。以2002年美国KENTUKY株为模板设计HA基因测序引物,进行RT-PCR,然后测定该分离株的HA基因核苷酸序列。经NCBI上Blast同源性比较发现,与A/equine/Newmarket/5/2003(H3N8)同源性较高为98.7%。HA蛋白遗传进化分析表明该毒株隶属于H3N8亚型马流感病毒中的美洲系福罗里达亚系。该株与OIE现在推荐的疫苗候选株A/equine/Kentuck-y/5/2002(H3N8)HA1蛋白氨基酸序列比对发现有3处氨基酸替换位点;与OIE以往推荐的疫苗候选株A/e-quine/Kentucky/1/1994(H3N8)比对发现有11处氨基酸替换位点。研究结果表明该分离株可作为中国研制马流感疫苗的候选株。