利用BmNPV多角体包埋外源蛋白的观察

家蚕核型多角体病毒在感染晚期大量表达产生多角体蛋白,并形成结构致密的超大分子蛋白质晶体,以有效保护内部包埋的病毒粒子,保证子代病毒的传播。借鉴多角体包埋病毒粒子的原理,观察到多角体也能将外源蛋白质固定入多角体内部。利用能形成多角体的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建的含有绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒能在表达、产生正常多角体的同时也表达EGFP蛋白。共聚焦分析表明,该重组病毒感染后形成的多角体能够发射绿色荧光。被包埋的EGFP蛋白放置1个月后仍能检测到绿色荧光,干燥处理30min后仍能检测到荧光。由此说明将多角体与外源基因同时表达,多角体中会包埋外源蛋白,且能较长时间保存外源蛋白的生物活性。这一现象为解决蛋白质长期保存提供了新思路,对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂也有很好的参考意义。     

BmNPV多角体蛋白片段引导外源蛋白固定入多角体的研究

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)晚期产生大量多角体,其主要作用是包埋病毒粒子免受外部恶劣环境的影响,为次代感染提供保障。将BmNPV多角体基因分段克隆并与报告基因——增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,利用BmNPVPolh+Bac-to-Bac表达系统构建重组病毒,使多角体蛋白与融合蛋白在BmN细胞内共表达。分析感染细胞和形成的多角体中融合蛋白的含量,研究不同的多角体蛋白片段引导EGFP固定入多角体的效果,结果表明构建的5种重组病毒都能大量表达融合蛋白,每种多角体蛋白片段都能引导EGFP固定入多角体内部,且外源融合蛋白在多角体总蛋白中占有较高的比例,其中,以多角体蛋白N末端100个氨基酸和完整多角体蛋白序列作为信号固定EGFP的效率最高。这一现象为解决活性蛋白长期保存提供了新思路,同时对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体也具有较好的参考价值。     

BmCPV多角体蛋白对异源蛋白的包埋

为了解家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体蛋白对异源蛋白的包埋作用,将BmCPV的多角体蛋白基因克隆至昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,转染家蚕卵巢培养细胞(BmN)后通过吉欧霉素(zeocin)筛选获得稳定表达多角体蛋白的细胞株。倒置荧光显微镜观察发现,转化BmN细胞有轻度的病理变化,细胞质中有呈绿色荧光的多角体蛋白结晶,但从转化BmN细胞中纯化的多角体无明显的绿色荧光。以修饰型线性化家蚕杆状病毒BmPAK6感染稳定转化BmN细胞,96 h后纯化多角体,回复感染显示多角体裂解液能感染家蚕BmN细胞,表明BmCPV多角体蛋白能包埋BmPAK6。纯化的多角体及多角体裂解液均能用X-gal显色,表明BmPAK6表达的β-半乳糖苷酶也能被BmCPV的多角体蛋白包埋。研究结果可为获得具有多角体的重组杆状病毒以及开发利用质型多角体蛋白包埋异源蛋白的功能提供新的技术途径。     

催青温度对家蚕抗核型多角体病毒 (BmNPV)影响的研究

以夏sch、秋sch为材料在不同温度下进行催青处理,分别在2、4、5龄起蚕期添食不同浓度梯度的家蚕核型多角体病毒(BmNPV),采用统计分析软件SPSS(Statistical Package for Social Sciences)10.0对所得结果进行了分析,获得了不同催青温度处理的伴性赤蚁蚕对BmNPV的抗性差异.实验中,34℃催青处理的伴性赤蚁(sch)蚕对BmNPV有最强的抵抗力.     

家蚕核型多角体病毒对寄主细胞凋亡抑制蛋白BmAPI5表达的影响

API5是一种新的细胞凋亡抑制蛋白因子,能有效抑制细胞凋亡。API5在结构与功能上高度保守,并已在包括家蚕在内的多种昆虫中发现存在同源基因。本文检测了家蚕幼虫BmAPI5基因在BmNPV和大肠杆菌侵染后的转录与表达变化。结果表明,微生物侵染能快速显著诱导BmAPI5基因的转录与表达,其中以BmNPV的诱导作用较为明显。这表明BmAPI5可能参与BmNPV-宿主的互作机制。     

家蚕核型多角体病毒四角形多角体的研究

BmNPVt是从BmNPVh中筛选出的一株四角形多角体病毒突变株。研究表明:BmNPVt的潜伏期、致病力、寄生部位、细胞病变同BmNPVh无甚差异;BmNPVt和BmNPVh之间存在干扰现象;Bm-NPVt的增殖类似于BmNPVh,但囊膜的形成方式两者之间不同。四角形多角体表面粗糙,具有小孔;它的外层电子密度较高,有一厚度为1500A的中间层。多角体蛋白晶格间距离为48A,分子量为29000dolt。同六角形多角体蛋白相比,四角形多角体蛋白的Glu含量较低,Tyr含量相对较高,胰酶酶切图谱两多角体蛋白存在差异。此外,多角体蛋白中Cu、Fe的含量和对酸碱溶解性,两多角体间也存在差异。BmNPVt为杆状,大小为330—340×85nm,纯病毒具有典型的杆状病毒紫外吸收特性,BmNPVt—DNA的变性温度为83℃,分子量为6.94×10~7dolt。镇江株、苏州株、日本株之间病毒DNA的EcoRI酶切图谱存在差异。     

稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立稳定转化家蚕细胞持续表达外源基因的技术体系,构建了基于piggyBac转座子的带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)和新霉素抗性基因(neo)表达元件的转基因载体pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA-fib-L-intron1,以及带有hGM-CSF和吉欧霉素(zeocin)抗性基因的昆虫细胞转化载体pIZT-IE-hGM-CSF,分别转染家蚕卵巢BmN细胞,并以含相应抗生素G418或zeocin的培养液筛选,得到稳定的转化细胞系FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF。ELISA检测结果显示,hGM-CSF在FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF转化细胞系的表达水平分别为1.534 55 fg/个细胞和2.227 38 fg/个细胞。     

构建稳定转化的BmN细胞表达人白介素-28A及表达产物的体外抗肿瘤活性

为建立能表达人白介素-28A(hIL-28A)基因的稳定转化家蚕卵巢细胞(BmN)系,构建了重组表达载体pIZT/V5-His-hIL-28A并转染BmN细胞,采用终浓度为300～400μg/mL的博莱霉素(zeocin)筛选2个月后,获得了稳定转化BmN细胞系。SDS-PAGE和Western blotting检测显示在稳定转化BmN细胞中表达的重组hIL-28A蛋白分子质量约为26kD;用ELISA试剂盒测定hIL-28A的表达水平约为2.035×10-5ng/个细胞。用噻唑蓝法(MTT法)检测hIL-28A的体外抗肿瘤活性,结果显示其对肺癌细胞A549、急性早幼粒细胞白血病细胞HL60、肝癌细胞BEL-7402和乳腺癌细胞M231的半数抑制浓度(IC50)分别为3.21、2.84、6.29和9.32ng/mL。研究结果表明hIL-28A可在稳定转化BmN细胞中表达,表达产物具有体外抗肿瘤活性。     

家蚕微孢子虫感染BmN细胞的差异表达基因筛选及Akirin的原核表达

为探究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染宿主细胞的分子机制,以感染Nb的家蚕卵巢上皮细胞(BmN)为材料,通过GeneFishing技术进行基因差异表达分析,发现感染Nb的BmN细胞有10个基因被诱导或抑制表达,这些差异表达基因功能涉及蛋白质合成、细胞信号转导、线粒体呼吸链电子传递、细胞能量代谢、细胞免疫及一些未知功能。运用RT-PCR方法克隆在感染Nb的BmN细胞中差异表达的免疫相关基因Akirin,获得一个长588 bp的完整ORF,编码195个氨基酸,预测蛋白质分子质量21.98 kD,等电点为8.97,属于碱性蛋白,该蛋白质经SignalP在线预测未见信号肽。通过原核表达获得家蚕Akirin的外源融合表达蛋白,为进一步研究家蚕Akirin在家蚕先天免疫系统中的功能奠定了基础。     

6种荧光蛋白基因在蒙古羊成纤维细胞中的表达

采用脂质体介导法，将绿色荧光蛋白（pEGFP—C1、pEGFP-N3）、增强型青色荧光蛋白（pECFP—N1、pECFP—mito）、黄色荧光蛋白（pEYFP—N1）和红色荧光蛋白（pDsRed1—N1）等6种荧光蛋白基因导入蒙古羊体外培养成纤维细胞中，对基因的时空表达、阳性细胞生长与增殖状况、细胞凋亡与细胞活力以及提高基因表达率的最佳方法等方面进行了深入的研究。试验结果表明：6种荧光蛋白基因在转染后24、48和72h的转染率在12．3％～63．3％之间，经多重比较，各试验组之间有较大差异。转染24h后，6种荧光蛋白都均匀地充满细胞质和细胞核，只有囊状小泡没有标记荧光；转染48h后，EGFP、ECFP和EYFP仍在整个细胞中均匀表达，呈弥散分布状态，随着表达量的增加，在细胞核局部呈现块状或颗粒状的基因表达产物；DsRed荧光蛋白基因则主要在细胞核膜周围呈现由诸多颗粒状表达产物组成的环状轮廓；在优化的条件下，细胞凋亡率、阳性细胞的形态、生长与增殖状况与对照组比较差异不显著（P〉0．05）。本研究结果对于标记基因、核移植及转基因动物克隆等研究具有重要的参考价值。     

黄花苜蓿游离细胞培养的初步研究

以黄花苜蓿(Medicago hispida)下胚轴和子叶来源的愈伤组织为材料,进行悬浮细胞振荡培养,经200目尼龙网过滤后得到游离的单细胞。这些细胞作浅层培养、可获得小细胞团。实验还观察到悬浮细胞存在多种形态,对其成因及繁殖方式作了简要讨论。     

柞蚕滞育蛹与非滞育蛹蛋白质表达差异初步分析

柞蚕是以蛹滞育越冬的昆虫之一,研究滞育蛹及非滞育蛹的蛋白质种类及含量的变化规律,有利于其滞育机理的解明。通过SDS-PAGE获得滞育与非滞育雄性柞蚕蛹的蛋白质图谱在分子质量16～105 kD范围内均出现清晰的25条带,其中大小为79、54、48、29 kD的蛋白质表达量较高,79 kD的蛋白质为高丰度表达的大分子质量蛋白质;采用2D-PAGE技术分析,在滞育蛹蛋白质样品中检测到的总蛋白质斑点数为400个,非滞育蛹蛋白质样品中检测到的总蛋白质斑点数为619个,非滞育蛹蛋白质斑点明显增多,二者蛋白点匹配率仅为37%,蛋白质的等电点变化剧烈,差异性较大,匹配率较低。研究结果提示柞蚕蛹滞育过程中蛋白质的数量和种类发生了明显变化。     

伪狂犬病病毒Ra株对不同细胞增殖特性及致病性研究

本研究以伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)Ra株体外感染不同的细胞系为模型,研究PRV Ra株最适细胞系。试验采用ST细胞、PK-15细胞、Vero细胞、F81细胞、DF1细胞、MDCK细胞和CEF细胞7种细胞作为该毒株的接种对象,观察毒株在这几种细胞上病变特点、细胞病变时间及病毒增殖规律等并进行比较。观察结果发现,受试的各种细胞在PRV感染期间均能表现明显的细胞病变,但不同细胞在病变时间上存在较大差异,其中PK-15和ST细胞在感染后24 h内出现明显细胞病变,时间最早。TCID₅₀测定病毒增殖力结果表明,ST细胞在病毒增殖传代中毒力保持最好,与原毒株毒力相当,为10^6.9 TCID₅₀/0.1 mL。本试验结果表明,ST细胞是较适合于PRV Ra株体外研究的细胞系。     

A Study on the Presence of Ferritin-binding Proteins in Fetal Horse Plasma

In mammal circulation, ferritin-binding proteins (FBPs) are thought to be involved in clearance of circulating ferritin after complex formation with it through receptor-mediated uptake. However, there is no report on fetal FBP in fetal circulation. Although iron concentrations of fetal horse plasma were higher than those of adult horse plasma, plasma ferritin concentrations and ferritin-binding activities were found to be significantly lower in fetus than in adult. FBPs were purified from fetal or adult horse plasma on horse spleen ferritin-Sepharose 4B affinity column. Partially affinity-purified fetal horse plasma FBPs were mainly separated into 65 and 41 kDa bands in addition to minor bands with higher molecular masses ranged from 102 to 140 kDa on SDS-PAGE under reducing condition. The adult horse plasma FBPs were separated into 74, 54 and 28 kDa bands, and the 74 and 54 kDa bands reacted with antibodies specific for horse IgM and IgG heavy chains, respectively, by immunoblotting analyses. On the other hand, no antibodies to horse immunoglobulin classes detected any bands in fetal horse plasma FBPs. The affinity-purified adult and fetal horse plasma FBPs did not contain fibrinogen as a plasma specific FBP, probably due to its lower affinity to the ligand ferritin. These results demonstrate the presence of FBPs which are different from adult horse plasma FBPs including anti-ferritin autoantibodies in fetal plasma.     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达

将含有传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ（从ＡＴＧ到Ｓ前体蛋白裂解位点）的片段克隆到具有多角体启动子（ＰＸＩＶ）和人工合成启动子（Ｐｓｙｎ）的杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，构建了重组转基因载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｓ１．Ｄ４１。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－ＧＤＮＡ（ｏｃｃ－，ｇａｌ＋）共转染草地夜蛾（Ｓｆ９）细胞，筛选并纯化出既能表达Ｓ１基因又能形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＩＢＶＳ１－ｏｃｃ＋（ｏｃｃ＋，ｇａｌ－）。通过间接ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等方法在感染了重组病毒的Ｓｆ９细胞中成功地检测到分子量约６２０００的Ｓ１基因表达产物。虽然该重组Ｓ１糖蛋白可能由于Ｎ－糖基化不完全而分子量小于天然蛋白，但它可以像正常病毒粒子一样，被鸡抗ＩＢＶＤ４１株血清特异识别。     

家蚕晚期胚胎原代细胞分化和转分化的研究

对家蚕晚期胚胎组织进行原代培养,记录了培养过程中出现的多种分化和转分化现象。发现已分化的晚期胚胎组织、细胞尚可继续分化和转分化形成各种不同类型的组织与细胞,而且这些细胞多有一定的增殖能力,暗示了家蚕晚期胚胎组织可能有多种内部器官组织的多能干细胞存在。