应用LD-PCR法构建大片吸虫成虫cDNA表达文库

为构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,用Trizol试剂提取大片吸虫成虫总RNA,经反转录合成cDNA第一链,应用LD-PCR扩增方法,合成双链cDNA。用SfiⅠ内切酶修饰此双链cDNA,使形成两端分别带有SfiⅠA和SfiⅠB的黏性末端。经CHROMA SPIN-400柱纯化,收集400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有SfiⅠA和SfiⅠB末端的λTriplEx2噬菌体载体,经体外包装后,以XL1-Blue为受体菌构建cDNA表达文库。经测定,库容量为1.08×106PFU/mL,重组率为96.6%。扩增后的文库滴度为2.41×109PFU/mL,插入片段平均大小约为1 000 bp。这些结果表明已成功构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,适合进一步筛选大片吸虫新基因。     

镰形扇头蜱肌钙蛋白I基因的克隆及其分布

本试验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST中筛选了1个含polyA尾的基因序列,经5LRACE方法得到该基因全长序列.经同源性比较,该基因预测的氨基酸序列与长角血蜱肌钙蛋白I(GI14041807)的同源性为84.47%,肌动蛋白结合位点位于147-167氨基酸处,且与长角血蜱肌钙蛋白I肌动蛋白结合位点完全相同,表明该基因是镰形扇头蜱肌钙蛋白I基因.以镰形扇头蜱基因组DNA为模板扩增到编码肌钙蛋白I的基因组序列.序列分析表明该序列不含内含子.RT-PCR分析表明该基因在镰形扇头蜱的卵及其幼蜱、若蜱、成蜱的壳、唾液腺和肠均有表达.     

镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅱ基因的克隆及其分布

本试验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST中筛选了1个含polyA尾的基因序列,经5′-RACE方法得到该基因全长序列。经同源性比较,该基因预测的氨基酸序列与长角血蜱肌钙蛋白（GI：14041807）的同源性为84.47%,肌动蛋白结合位点位于147～167氨基酸处,且与长角血蜱肌钙蛋白肌动蛋白结合位点完全相同,表明该基因是镰形扇头蜱肌钙蛋白基因。以镰形扇头蜱基因组DNA为模板扩增到编码肌钙蛋白的基因组序列,序列分析表明该序列不含内含子。RT-PCR分析表明该基因在镰形扇头蜱的卵及其幼蜱、若蜱、成蜱的壳、唾液腺和肠均有表达。     

镰形扇头蜱微管蛋白基因的分离和cDNA序列分析

分离和鉴定镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides,Rh）新基因,为防治镰形扇头蜱提供药物靶标或候选疫苗。从镰形扇头蜱唾液腺抑制消减杂交文库中筛选了一条编码微管蛋白的基因片段,通过3＇-RACE的方法得到全长序列;采用生物信息学技术等对该cDNA进行分析。获得1个镰形扇头蜱新基因-微管蛋白基因（RhM1）,全长680bp,开放阅读框（ORF）全长537bp,编码179个氨基酸。编码蛋白的理论分子量为20KDa,等电点为4.71;抗原表位可能位于cDNA序列N末端第18~25氨基酸处。     

镰形扇头蜱金属蛋白酶基因全长的克隆和序列分析

本研究从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST序列中筛选了一个含polyA尾的基因序列,经5′-RACE方法得到该基因全长序列。cDNA全长1 566 bp,编码区为23 bp～1 456 bp,编码478个氨基酸残基,该蛋白的预测分子量约为55 Ku,等电点为8.87。RT-PCR分析表明,该基因在镰形扇头蜱未吸血成蜱、半饱血成蜱以及唾液腺、肠中表达。     

镰形扇头蜱唾液腺、中肠和卵的菌群结构

采用PCR-DGGE技术分析了镰形扇头蜱雌成蜱中肠内容物、唾液腺、虫卵的菌群结构。无菌条件下采集镰形扇头蜱雌成蜱中肠内容物、唾液腺、虫卵,提取细菌总DNA;以通用引物扩增细菌16SrDNA V3区;DGGE电泳,回收、克隆、测定DGGE优势条带。结果表明,饱血和半饱血雌蜱中肠菌群结构相同,中肠内容物、唾液腺和虫卵部分细菌相同;9条明显条带的序列分别与柯克斯体属(Coxiella sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、涅斯捷连科菌属(Nesterenkonia)、共生菌(Symbiotic bacteria)和未培养土壤细菌的16SrDNA V3区序列高度相似。分离到2株细菌,为模仿葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌。     

镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP基因的克隆和重组表达

为了进行抗蜱及蜱传病疫苗的研究,本试验根据GenBank中的镰形扇头蜱组胺结合蛋白(Rhipicephalus haemaphysaloideshistamine bindingprotein,RhHBP)基因cDNA序列,设计一对特异性引物(内含EcoRI/XhoI酶切位点),经RT-PCR扩增了镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP的cD-NA,大小为603 bp,将其克隆到pGEM-Teasy中并测序。在去除编码RhHBP信号肽的核苷酸序列后,将其亚克隆到pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1-RhHBP,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为1 mmol/L IPTG诱导其表达,表达的融合蛋白大小为49 ku,以包涵体的形式存在。Western Blot分析表明,该蛋白具有良好的免疫原性。     

镰形扇头蜱组胺结合蛋白全长基因的克隆与分析

从本实验室构建的镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）抑制消减杂交cDNA文库中选择了1条可能编码组胺结合蛋白（HBP）的EST序列（RhHBP）,以5′末端快速扩增的方法（5′RACE）扩增获得5′末端序列,拼接获得全长基因。DNAMAN（v4.0）、DNAstar（v4.0）和Genetyx（v4.0）软件分析阅读框、编码产物、序列同源性和系统进化,同时也分析了该基因在吸血前后雌雄蜱体内的表达情况。5′RACE法获得1条约400 bp的DNA片段,克隆测序,拼接获得1条长803 bp的全长基因,编码219个氨基酸残基。该基因在吸血雌蜱唾液腺内特异表达,初步分析该基因是组胺结合蛋白基因。     

镰形扇头蜱-新基因的分离、克隆、表达和抗蜱免疫保护作用

目的分离、克隆镰形扇头蜱一新基因。方法本实验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的100个EST（Expressed Sequence Tag）序列中选取一个带有polyA尾的序列，经5’RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）得到此序列的全长基因，命名为RhHp2，基因全长1002bp，开放阅读框（ORF）从31bp至879bp，共848bp，编码282个氨基酸。经序列比较，RhHp2基因与其它序列在核苷酸水平上基本无同源性，但在氨基酸水平上与其它物种同源性最高可达50．81％。RhHp2基因连接于PET32a（＋）载体后克隆于表达菌B121，1mM IPTG诱导表达，产生分子量约为55kD的融合重组蛋白，并以不溶性包涵体形式存在。经纯化和体外复性的重组蛋白三次免疫新西兰兔后，将镰形扇头蜱未吸血成蜱和若蜱接种于此免疫兔耳，并对接种48h后的蜱上体数、蜱的饱血数量、饱血时间、饱血重量等进行记录。结果发现蜱的吸血行为受到一定影响，若蜱在48h的减虫率（上体数减少）为58％，在整个吸血过程中的死亡数增加，成蜱的饱血体重显著降低。结论此结果表明RhHp2基因的重组表达产物具有一定的免疫保护作用。     

镰形扇头蜱免疫球蛋白结合蛋白的表达及免疫保护分析

为在大肠杆菌中高效表达镰形扇头蜱免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin binding protein,IGBP),并对表达产物进行免疫保护效果测定,将IGBP基因克隆到pGEX-4T-1载体,转化到感受态细胞BL21,在IPTG诱导下进行表达;表达产物3次免疫家兔,剂量为500μg/只。3次免疫后进行攻蜱试验,观察免疫保护效果。结果发现在IPTG的诱导下,重组质粒pGEX-4T-1-IGBP在大肠杆菌中获得高效表达,产生GST-IGBP融合蛋白,用融和蛋白免疫家兔后,试验组与对照组成蜱饱血重量和死亡率差异显著(P<0.05)。表明重组质粒pGEX-4T-1-IGBP能在大肠杆菌中高效表达,且表达蛋白能够对家兔产生一定程度的抗蜱保护性免疫力。     

不同吸血时段蜱粪便蛋白组学比较分析

为了解蜱血液消化特征,通过耳袋饲养法分别收集镰形扇头蜱雌性成蜱吸血d4、d8的粪便。提取粪便蛋白质,进行SDS-PAGE和LC/MS-MS分析。用非标定量分析蛋白组学技术对蜱不同吸血时段粪便进行差异蛋白质表达谱分析。结果共鉴定蜱源肽段数628个、蛋白质总数196个;鉴定兔源肽段数6173个、蛋白质总数659个。对组间差异蛋白分析发现,除一些未知蛋白外,其中蜱源蛋白主要是热休克蛋白、免疫蛋白相关亚基和一些蛋白酶类等。兔源差异蛋白主要为一些凝血因子、糖蛋白,以及一些物质和能量的消化与合成的相关酶类,如兔丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、三磷酸肌苷焦磷酸酶、S-(羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶等。本研究中的粪便蛋白质组反应了蜱血液消化过程的复杂性,丰富了蜱消化方面的研究数据,同时为抗蜱疫苗研究提供了一个思路。     

湖北省水牛巴贝斯虫病调查研究 Ⅴ.镰形扇头蜱经卵传递牛巴贝斯虫的证实

1986年从病牛身上摘下饱血雌蜱,经实验室饲养,孵化为第二代成蜱,人工越冬。于1987年将上述蜱100只接种于已去脾23天的一岁龄健康水牛,以后每天从该牛身上取蜱查其唾液腺。结果在吸血期间,始终查到梨形虫体,其平均大小为1.3×0.68微米。接种后第4天,牛血中开始出现巴贝斯虫,至第19天,红细胞感染率高达9.6％,单梨形虫体大小为0.84～2.64×0.42～1.22微米,双梨形虫体大小为0.64～1.64×0.37～0.97微米,以后逐渐下阵。该牛出现体温升高)41.6℃)、严重贫血(血红蛋白量2克,红细胞压积14％,红细胞总数177万/毫米~3)、黄疸及精神萎顿等症状。上述结果表明,该牛感染了巴贝斯虫病,由此证实镰形扇头蜱是经卵传递巴贝斯虫,其感染阶段是成蜱。     

应用镰形扇头蜱及巴贝斯虫病水牛的染虫血感染黄牛试验

从非流行区购进无蜱寄生的健康黄牛５头与水牛犊１头，其中３头成年黄牛（２～８岁）在畜舍内用从流行区水牛身上采得的镰形扇头蜱Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓ成虫，置于牛耳壳内叮咬；１头运至流行区放牧，让蜱上身叮咬；１头黄牛犊（１０年龄）去蜱后２周，用液氮保存的患病水牛染虫血４ｍｌ（４×１０ ８个虫体）皮下注射；另一头去蜱水牛犊亦同时注射相同剂量的染虫血，作为对照。５头黄牛在试验期间其体温、精神、食欲正常，未出现任何临床症状，感染后１０～１２ｄ外周血液中出现少量不典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率在０．１％以下，持续３～５６消失；对照牛则体温升高（３９．８～４１．１℃），出现贫血、黄疸等症状，红细胞压积（ＰＣＶ）降至２６％，外周血液中出现典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率（ＰＰＥ）高达１２％。对采用蜱叮咬及注射来自病水牛的染虫血为何不能使黄牛感染发病，文中进行了讨论。     

寄生于中国水牛Bubalus Vbubalis的巴贝斯虫一新种(梨形虫目:巴贝斯科)

经作者等深入研究，发现湖北省水牛巴贝斯虫病病原不是牛巴贝斯虫Ｂａｂｅｓｉａｂｏｖｉｓ与双芽巴贝斯虫Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ，而是一新种——东方巴贝斯虫Ｂａｂｅｓｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓｓｐ．ｎｏｖ．。病牛红细胞中的虫体呈梨形（单梨形多于双梨形）、椭圆形、指环形、边虫形及杆状。以梨形虫体居多，病的初期其长度均小于红细胞半径，其平均大小为２．２×１．３μｍ，双梨形虫体尖端相连多排列成钝角或一字形，位于红细胞偏中央处。病的后期（出现虫血症后５～６ｄ）及体外培养７２ｈ，有少部份（１～２％）虫体直径大于红细胞半径。新种的传播者为镰形扇头蜱Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓ经卵传递（由第二代成蜱传给健康牛）。在成蜱的血淋巴中的虫样体（裂殖子）呈圆锥状、一端钝圆、尾部直而尖，不形成钩。新种对黄牛不能感染致病，只能使水牛致病。以１９９培养基加黄牛血清进行体外培养（微气静相培养技术）不能生长繁殖     

镰形扇头蜱重组肌钙蛋白I抗蜱免疫保护效果的初步分析

为了评估镰形扇头蜱肌钙蛋白I（TroponinI,TnI）作为候选疫苗分子的潜力,应用肌钙蛋白I重组蛋白进行了抗蜱免疫实验。将重组蛋白按常规方法免疫新西兰兔,三次免疫后分别用若蜱、成蜱进行攻虫实验,观察其免疫保护效果。结果发现蜱的吸血行为受到一定的影响,与对照相比,若蜱和成蜱吸附率、饱血率、饱血体重和死亡率有显著差异,而在饱血时间上差异不显著,说明TnI基因的重组表达产物具有一定的免疫保护作用。