一个响应土壤缺铁拟南芥突变体的分离及鉴定

铁是植物生长发育必需的一种微量元素,但土壤中植物可直接吸收利用的铁非常有限。缺铁使作物生长受限,进而影响人类膳食健康。植物体能通过调节一系列基因表达的变化来响应缺铁,但目前对该调控系统的研究仍不完善。CYP82C4(At4g31940)是拟南芥中一个强烈响应缺铁的基因,本研究将该基因启动子连接荧光素酶报告基因LUC2并转化拟南芥,进一步通过T-DNA的随机插入得到一个响应缺铁信号的突变体库。通过筛选该突变体库,我们得到一个强烈响应缺铁信号的突变体L22-8。和野生型相比,正常情况下L22-8地上部和地下部内源CYP82C4的表达量均显著增高,缺铁处理时其地上部表达量仍高于野生型,而地下部则不明显。定量结果显示FIT,b HLH38和b HLH39等植物铁代谢关键调控因子的表达发生了显著变化,但植株总铁、磷、锌的含量较野生型并没有显著区别,表明该T-DNA的插入虽影响了植株对缺铁胁迫的响应,但并不直接作用于植株对铁的吸收、转运上。反向PCR分析发现L22-8的T-DNA插入位点位于At3g51950和At3g51960之间,且这两个基因的转录表达在正常生长条件下均略低于Col-0。基因互补实验发现仅有At3g51960能部分互补L22-8的荧光信号,表明At3g51960基因的表达影响了CYP82C4对缺铁胁迫的响应。本研究进一步扩展了植物吸收利用铁的分子调控网络,为分子育种工作提供了指导。     

At2g29080基因可能参与了拟南芥盐代谢的调节

为进一步阐明植物盐代谢机理，以哥伦比亚生态型（Columbia type)野生拟南芥（Arabidopsis thaliana)及其盐敏感突变性（salt overly sensitive2,sos2）为材料，50mmol/L NaCl处理3d，利用mRNA差异显著显示技术分离得到了只在野生型拟南芥中表达，而在sos2突变体中不表达的一个未知功能的At2g29080基因片段DD156。序列同源性分析表明，它是一类大的蛋白家族AAA ATPase（ ATPase associated to a variety of cellular activities)中一员。Northern blot显示，随着NaCl处理浓度的升高。该基因在野生型拟南芥中的表达量增加。而在sos2突变体中，该基因的表达一直处于很低水平。这是首次发现AAA ATPase与植物的盐代谢有关。进一步研究发现，线粒体细胞色素氧化酶活化的变化，与与该基因在野生型和sos2突变体中的表达呈密切相关。表明该基因的编码产物可能参与了拟南芥线粒体细胞色素氧化酶活性的调控。     

毛叶苕子磷饥饿响应基因VvPHR1的克隆及功能研究

【目的】磷饥饿响应因子PHR (phosphate starvation response)在植物根系发育和磷养分吸收中起重要作用,本研究主要阐明毛叶苕子VvPHR1基因生物学功能,为培育磷高效型绿肥作物提供理论依据。【方法】通过转录组测序获得毛叶苕子VvPHR1基因序列。采用酵母单杂交方法验证VvPHR1基因的转录激活功能,构建其过表达载体,利用花粉管通道法分别遗传转化野生型和突变体(Atphr1)拟南芥,获得超量表达VvPHR1基因和突变体功能回补转基因材料。对正常磷(1 mmol/L Pi)和低磷(1μmol/L Pi)的培养基中生长30天的拟南芥取样,采用实时荧光定量PCR对野生型和转基因拟南芥中VvPHR1及下游磷转运基因的表达进行分析,并对转基因材料进行表型分析,测定其主根长、鲜重、总磷及无机磷(phosphate,Pi)含量。【结果】毛叶苕子转录组中有13个PHR基因,转录本129590、96227、120424与拟南芥的PHR1相似度最高,其中转录本120424在低磷诱导下表达量最高,将该转录本命名为VvPHR1基因。该基因cDNA全长1008 bp,编码335个氨基酸...     

黄瓜生长素受体同源基因CsAFB和CsTIR在拟南芥中的转化与功能表达

植物生长素受体是生长素信号通路中的重要因子.基于前期克隆得到了黄瓜(Cucumis sativus)生长素受体同源基因生长素信号F-box蛋白基因(auxin signaling F box protein,CsAFB)和转运抑制响应基因(transport inhibitor response,CsTIR),为进一步证实和研究这2个基因的功能,本研究利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0野生型和生长素受体编码基因功能缺陷突变体tirl-1为材料,导入黄瓜生长素受体同源基因,获取纯合转基因系.检测发现,拟南芥突变体tirl-1转入CsAFB/TIR基因后根系发育、外源生长素敏感性和细胞伸长反应均恢复至野生型水平.检测发现,野生型拟南芥中过量表达黄瓜CsAFB/TIR,尤其是Cs TIR基因,植株主根伸长明显受抑,侧根数量剧增,子叶下卷,叶柄上翘,真叶叶缘向离轴面弯曲,顶端优势明显.本研究表明,CsAFB/TIR基因功能类似拟南芥TIR1基因,为黄瓜生长素受体同源基因;过量表达该类基因通过增加生长素受体数量、扩大生长素信号的方式参与调控植物生长发育;为进一步在黄瓜中研究生长素受体功能及作用机理提供理论依据.     

拟南芥抗致病疫霉突变体T-DNA 侧翼序列分析

本文通过将致病疫霉不同菌株接种到拟南芥Col-0生态型激活标签突变体上，筛选出了感致病疫霉的类型，以筛选出的拟南芥感病突变体基因组DNA为模板，利用热不对称交错PCR方法(Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)，进行了抗性相关基因的研究。通过TAIL-PCR技术，获得了拟南芥T-DNA插入侧翼序列，利用拟南芥基因组全测序的优势，通过NCBI进行序列的同源性比对找到相应的基因。结果发现，TAIL-PCR可以有效地扩增T-DNA插入侧翼拟南芥基因组序列，AD1，AD2，和AD4是最佳随机引物。对8个TAIL-PCR特异产物测序分析，证明3个T-DNA插入在基因上。     

拟南芥突变体amos2对外源激素的响应特征研究

检测拟南芥突变体amos2对外源激素响应的结果表明,该突变体主根伸长对外源生长素有明显的抗性,其主根抗性强于拟南芥野生型(WT),但弱于已知的生长素突变体aux1-7和axr4-2。该突变体的主根伸长对生长素转运抑制剂TIBA也表现出较强抗性,而对一定浓度的ACC表现敏感,但主根伸长对外源6-BA和ABA的响应与野生型一致。外源添加生长素或乙烯抑制剂可同时增加amos2和野生型的可见侧根数量,但突变体的增加百分比要显著高于野生型。虽然amos2突变体的荚果败育率比野生型显著增加,但并未表现出其他生长素突变体特有的胚轴弯钩消失及根系向重性缺失的表型。上述结果暗示突变基因AMOS2在控制拟南芥生长发育的某些方面发挥重要作用。     

在烟草中表达拟南芥GAI基因获得矮化的烟草植株

赤霉素（GA）能控制植物茎的伸长，从而决定植物的高度（Schomburg et al．，2003）。一些植物的矮化突变体是由于体内GA缺陷、GA不敏感引起的（Ross et al.，1997）。因此，改变植物体内GA的浓度和对GA的敏感性都可能改变植物的高度，获得矮化植株。GAI是一个在拟南芥中发现的GA应答的负调控因子，过量表达引起植株矮化（Peng et al．,1997．Fu et al．，2001）。本研究克隆了拟南芥GAI基因，在烟草中表达获得了矮化的烟草植株。     

氮素吸收调控中铵转运蛋白与锚蛋白的互作研究

铵转运蛋白（AMT）介导的高亲和力铵跨膜运输是植物根系吸收铵态氮的主要途径。AMT蛋白水平上的调控能够快速有效地控制根系铵吸收能力,但参与调控的互作蛋白尚未见报道。本研究通过生物信息学手段预测得到铵转运蛋白AtAMT1;3可能和锚蛋白AtAnkTm8存在互作。基因表达分析实验发现AtAMT1;3和AtAnkTm8的根中组织特异性表达模式一致,并同时受到缺氮胁迫的上调表达,结果支持了它们互作的可能性。筛选鉴定出AtAnkTm8缺失突变体,分析在供铵条件下及对甲基铵敏感性的生长表型,结果发现AtAnkTm8的缺失没有影响拟南芥根的铵吸收能力,推测可能存在其他家族成员的功能冗余。AMT与AnkTm的互作为理解植物铵吸收调控过程提供了可能的新颖机制     

拟南芥Nodulin MtN21家族At1g0938基因功能的初步研究

拟南芥Nodulin MtN21 蛋白家族含有1～2个DUF6结构域,具有内在膜蛋白的特性。推测该家族基因在小分子跨膜运输、信号转导和抗逆性等方面发挥作用。At1g09380是拟南芥Nodulin MtN21 基因家族成员。本研究通过PCR筛选获得At1g09380对应的T-DNA 插入纯合子,并通过RT-PCR鉴定该突变体为无效突变体。对突变体萌发和萌发后阶段进行盐胁迫和干旱胁迫分析,结果表明,At1 g09380 突变体萌发后对NaCl和干旱胁迫敏感,证明该基因参与拟南芥的盐和干旱胁迫响应过程。同时还发现在长日照条件下突变体植株比野生型植株早开花7d左右。以上研究结果为进一步分析该基因的生物学功能打下基础。     

小麦穗型突变体表型及其转录组分析

为了明确突变体小麦穗型变化的分子机制,对源自扬辐麦4号的穗型突变体sui1进行表型分析,并在不同的穗生长阶段（孕穗期T1、灌浆期T2）,对突变体sui1与野生型的穗轴节和穗下节进行转录组分析。结果发现,相较于野生型,突变体的穗轴节、穗下节长度变短,株高降低,赤霉病发病程度加重。转录组分析结果表明,相同时期穗下节差异表达基因多于穗轴节,相同组织孕穗期差异表达基因多于灌浆期,筛选出差异表达基因2 526个,其中上调基因890个,下调基因1 636个;对差异表达基因进行基因本体论（GO）分类发现,不同组织的分子功能注释基因在两个时期富集相同,大部分集中在三磷酸腺苷（ATP）结合上;差异表达基因京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果发现,植物-病原体互作通路富集基因最多,不同时期生物中的碳固定通路富集因子最高,不同组织光合作用-天线蛋白通路富集因子最高;对差异表达基因进行植物-病原体互作通路基因筛选,筛选出相关基因160个,其中防御反应基因63个（39%）,蛋白激酶活性基因21个（13%）,二磷酸腺苷（ADP）结合基因18个（11%）,推测这些基因可能对小麦突变体sui1穗轴节及穗型...     

拟南芥抗致病疫霉突变体部分序列分析

目前获得拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体的主要方法是采用激活标签法(activation tagging)(Kakimoto,1996;Kardailsky et al.,1999)。本实验根据拟南芥突变体对致病疫霉表现的抗性差异,利用TAIL-PCR技术对感致病疫霉的拟南芥突变体进行遗传分析,为克隆拟南芥抗致病疫霉基因提供资料。     

大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶accD亚基表达载体的构建及遗传转化研究

为探索大肠杆菌异质型乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）的β-CT亚基accD基因对油料作物含油量的影响,将目的基因E.coli accD（eaccD）与拟南芥Rubisco小亚基（rbcS）转运肽基因融合,构建以油菜Napin启动子驱动的种子特异表达载体。本试验应用农杆菌介导法,将该表达载体转入油菜,通过PCR检测获得了...     

小肽转运蛋白(PepT1)及其活性调控

小肽是蛋白质消化的主要产物，在氨基酸消化、吸收以及动物营养代谢中起着重要的作用。小肽转运蛋白（PepT1和PepT2）的克隆揭示了动物小肽转运的机制。主要综述了小肽转运蛋白（PepT1）的分子结构特征，PepT1mRNA在不同动物、不同组织中的分布，以及各种因素对PepT1转运活性的影响，并就需要进一步深入研究的问题进行了探讨。     

毛竹PheFT12a基因过表达对拟南芥开花及芽发育的影响

FLOWERING LOCUS T(FT)亚家族在植物生长发育过程中发挥着重要作用。为探究毛竹FT基因的表达特性及生物学功能，本研究通过反转录PCR(RT-PCR)从毛竹中克隆到1个FT同源基因PheFT12a，该基因编码区序列长度为522 bp，包含典型的4个外显子和3个内含子，编码173个氨基酸，编码蛋白包含完整的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）结构域。系统进化树分析结果显示，PheFT12a与水稻（Oryza sativa）OsFTL12的亲缘关系最近，与OsFTL2(Hd3a)和拟南芥（Arabidopsis thaliana）FT的亲缘关系相对较远。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示，PheFT12a基因在毛竹实生苗叶片中表达最高，茎次之。亚细胞定位结果显示，PheFT12a蛋白定位于细胞核和细胞质，主要富集于细胞核。转化拟南芥ft突变体表型结果显示，PheFT12a能明显回补ft突变体的晚花表型，可提高回补植株的主茎数和侧枝数。本研究为进一步分析PheFT12a的生物学功能提供了参考依据，并为毛竹开花及芽发育的分子机制提供了基础资料。     

LRR-RLKs亚家族基因RLK6在拟南芥开花过程中的作用

为研究LRR-RLKs亚家族基因RLK6(AT2G26730)在拟南芥生长发育过程中的作用,本研究构建了植物过表达载体p Super1300-RLK6,获得5个过表达突变体,其中2个独立株系(OE8,OE9)用于表型分析。通过对野生型(WT)、RLK6基因缺失突变体(rlk6-2、rlk6-3和rlk6-6)、过表达株系OE8和OE9生长发育过程的详细观察和分析发现,RLK6基因缺失突变体在整个生长发育过程中的表型与WT差异不明显,而过表达株系OE8和OE9比WT开花早。此外,利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测各基因型植株中开花相关基因的表达情况,结果表明,相对于WT,OE8和OE9中的开花促进基因CO、SOC1和LFY的表达量显著升高,而开花抑制基因FLC的表达量显著下降。研究结果说明RLK6过表达促进了拟南芥的开花,这为后续深入研究RLK6的作用机制奠定了基础。     

大白菜BrWRKY33基因上游调控序列的克隆及其功能研究

根据大白菜EST和基因组序列,利用PCR技术从大白菜品种龙白二号（Brassica rapa subp.pekinensis cv.LongbaiⅡ）基因组中克隆转录因子基因BrWRKY33起始密码子上游大小1755bp的调控序列。然后,构建5＇端缺失突变体,与gus基因融合,构建植物表达载体。将载体转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型（Columbia ecotype）,进行植物组织GUS化学染色分析。结果表明,BrWRKY33密码子上游-1755～-315区域存在的多个W-box元件可能与该基因表达的负调控相关,-315bp区域含有BrWRKY33基因转录必需的基本元件。对接种软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）后不同时期的植株进行染色,发现该病原菌侵染使转基因植株gus基因表达量增加,表明BrWRKY33基因在植物对软腐病抗性反应中具有一定的作用。     

番茄SlMIP基因参与转基因拟南芥的渗透调节

本实验以野生型（WT）和转番茄SlMIP基因的拟南芥为材料,研究NaCl胁迫条件下对二者体内渗透调节特征的影响。结果发现, 在NaCl胁迫下,转SlMIP基因的拟南芥细胞膜损伤程度较轻,组织渗透势显著降低,并保持较高的组织含水量,生长受抑制程度明显低于野生型植株。转基因植株体内Na+ 含量和Na+/K+ 比值显著低于野生型拟南芥,K+含量虽有所下降但仍显著高于野生型植株,而且在盐胁迫下脯氨酸和可溶性糖含量也高于野生型拟南芥,表明转入番茄SlMIP基因后的拟南芥,通过增加水分子的吸收,减少钠离子的进入,增加了细胞内脯氨酸和可溶性糖的含量,进而影响植物的有机渗透调节能力,与此同时可能通过离子化区隔机制以及与质膜Na+/H+逆向转运蛋白的相互作用更有效地调节细胞内外的无机离子交换能力,使植物更有效地抵御盐害,表明番茄SlMIP水通道蛋白基因在植物盐胁迫下具有重要的渗透调节作用。     

苜蓿根瘤菌聚羟丁酸解聚酶基因(phbD )突变体的构建及其特性

摘要: 根据苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti ) Rm1021基因组中与Ralstonia eutropha phaZ基因同源部分序列设计1对引物，从S. meliloti基因组中用PCR扩增出835 bp phbD 基因片段并克隆到载体pGEM?襆-T Easy上；通过在phbD基因内插入ΩSmSp和基因置换构建了phbD突变体。该突变体可积累比野生型菌株多1.0~2.6倍的聚羟丁酶（PHB）。在YMA和TY平板上形成非粘液型菌落，而在以乙酰乙酸或3-羟丁酸为唯一碳源的M9基本培养基（M9-AA，M9-HB）上形成粘液型菌落。碱性磷酸酶测定结果表明，通过接合引入phbD突变体菌株中的exoF-phoA融合基因在YMB培养基中低量表达，而在M9-AA和M9-HB中高量表达。     

蛋白质组学分析揭示水稻地上部对缺铁和高铁胁迫的响应

铁在矿质土壤中含量丰富，但在中性和碱性土壤中大多以不易被植物吸收利用的氧化物或氢氧化物形式存在；稻田土壤在淹水条件时氧化还原电位较低，大量铁以易被植物吸收利用的亚铁形式存在。土壤中铁的生物有效性过低或过高均会导致植物的生长发育受阻。本研究对缺铁（0 μmol?L-1）、铁充足（40 μmol?L-1）和高铁（350和500 μmol?L-1）条件生长的水稻地上部进行了非标记蛋白质组学分析。结果显示，与铁充足条件相比，缺铁和两种浓度的高铁胁迫水稻中分别有130、157和118个蛋白质的丰度发生显著变化。基因本体富集分析显示，缺铁和高铁胁迫下的差异蛋白在初级代谢过程、有机氮化合物代谢过程、蛋白质代谢过程和细胞成分组织或生物发生等生物学过程均显著富集；差异蛋白还参与核糖体、光合作用和氧化磷酸化等代谢途径。缺铁胁迫显著影响参与苯丙烷类物质和辅助因子生物合成的蛋白质丰度，而高铁胁迫则引起氨基酸生物合成过程的蛋白质丰度发生显著变化。本研究发掘到一系列可用于水稻铁高效育种工作的候选蛋白，还发现了一些功能未知的差异蛋白可作为后续水稻铁胁迫响应的研究目标，同时为理解植物应对铁胁迫的完整响应网络提供了补充信息。     

UV-B诱导拟南芥查耳酮合成酶（CHS）基因表达及其信号传导途径

应用RT-PCR技术研究了6个拟南芥（Arabidopsis thaliana）株系的查耳酮合成酶（CHS）基因转录对UV-B照射以及过氧化氢（H2O2）、D/L-NG -一甲基精氨酸（D-NAME、L-NAME）和2-苯基-l-4,4,4,4-四甲基咪唑啉-1-烃氧基-3-氧化物（PTIO）等化合物处理的响应。结果表明，在6个株系中，Fah1-2突变株UV-B伤害最为敏感，而野生型WS2对UV-B伤害耐受力最强；在15 μmol/m2/s UV-B照射2 h，CHS基因转录产物明显增加，但24 h后消失。H2O2对CHS基因转录没有显著作用，D-NAME 和L-NAME能抑制CHS在UV-B照射下表达转录的增加，而PTIO对CHS基因表达的抑制作用很弱。据此认为，CHS基因对UV-B照射响应的表达和转录不受NO和H2O2的调节