银杏GbPAL基因启动子表达载体的构建

为弄清GbPAL启动子调控类黄酮代谢的功能,采用双酶切方法,用BamH I+HindⅢ将GbPALp与植物表达载体pBI121分别酶切纯化,通过T4DNA连接酶将GbPALp片段连接到已切除35S启动子的植物表达载体pBI121上,并转化到农杆菌LBA4404上,然后进行菌落PCR及酶切鉴定。结果表明:扩增到的GbPALp片段成功引入了BamH I和HindⅢ酶切位点,GbPALp酶切后与酶切前的条带大小一致;将酶切后的空质粒和引入酶切位点的目的片段进行连接转化后,含目的基因pBI121:GbPALp:LBA4404菌落培养成功。成功构建了GbPAL基因启动子真核表达载体pBI121:GbPALp。     

3种不同启动子构建ACC脱氨酶基因植物表达载体

从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)UW4菌株克隆出ACC脱氨酶(1-aminocyclopmpane-1-carboxylic acid deaminase)基因连接至pGEM-T vector上,并采用3种不同启动子(组成型表达启动子CaMV35S、花特异表达启动子CHSA及衰老特异表达启动子SAG12)分别构建ACC脱氨酶基因的植物表达载体,经PCR及酶切鉴定均已构建成功.为后期选择不同的花卉等植物材料遗传转化研究打下基础.     

花药特异表达基因TaRAFTIN1a启动子的克隆及表达载体构建

组织特异性启动子是植物基因工程改良的重要工具。RAFTIN是禾本科植物花药绒毡层中特异积累与花药发育相关的蛋白,其调控序列可能提供一个很好来源的花药特异性表达启动子。为了解小麦TaRAFTIN1a基因启动子的花药表达特异性,本研究分离了TaRAFTIN1a基因的启动子,生物信息学分析表明,该启动子含有3种花药特异表达元件(总计10个),1个ABRE脱落酸响应元件,TGACG-motif与CGTCA-motif茉莉酸甲酯响应元件各1个,8个ARR1AT细胞分裂素响应元件,以及2个DRE和1个MBS干旱响应元件。采用5'端缺失的方法,分别克隆1429、898和351 bp的启动子片段,经连接、转化与鉴定,构建了3个含TaRAFTIN1a启动子不同区段融合GUS报告基因的植物表达载体,p WAER1,p WAER2,p WAER3,为通过转基因了解启动子的表达特征及其核心作用元件奠定了基础。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对番茄的转化

利用PCR技术从烟草中克隆获得了893bp的根特异性表达基因TobRB7的启动子,命名为NT1.以pBI121为原始植物表达载体,用NT1启动子和番茄广谱抗病基因Pto分别取代CaMV 35S启动子和GUS基因,获得了烟草根特异启动子驱动抗病基因的表达载体,命名为pBI-NT1::Pto.采用冻融法将pBI-NT1::Pto导入根癌农杆菌EHA105中,以番茄子叶为外植体进行了侵染转化.PCR检测NPT II基因的结果表明已获得转基因番茄植株.     

2种启动子驱动下的VaCBF3基因植物表达载体构建

为了探索山葡萄CBF3基因(VaCBF3)对杨树的遗传转化的影响,及组成型启动子和诱导型启动子对转基因植株生长的影响,分别构建由2种类型启动子调控的植物表达载体.根据GenBank上公布的rd29A基因序列设计特异性引物,利用PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆rd29A基因启动子片段,利用限制性内切酶通过酶切、连接构建由组成型启动子35S和诱导型启动子rd29A基因启动子驱动的VaCBF3基因植物表达载体,利用冻融法完成重组质粒对根癌农杆菌LBA4404的转化.试验结果表明,所克隆的rd29A基因启动子片段序列分析表明该启动子片段长度为945bp,与GenBank中基因序列同源性达99％,具有DRE、ABRE、TATAbox和CAAT box4个完整的顺式作用元件,具有启动子功能.经过酶切、连接成功地将目的基因与载体质粒连接,并将重组质粒导入至根癌农杆菌LBA4404中,为下一步利用农杆菌介导法对杨树的遗传转化及研究2种启动子的启动效率奠定了一定的基础.     

新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子表达载体的构建

为了进一步研究新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子的功能,采用双酶切的方法,用核酸内切酶SacⅠ和NcoⅠ分别双酶切pCAMBIA1304质粒和阳性重组质粒pEASY-T1-simple-pMvNHX1,然后回收目的片段。通过T4DNA连接酶将目的片段和空载体相连后获得连接产物。将连接产物导入到宿主菌DH5α,通过画板,卡那霉素筛选后挑单菌落摇菌。然后用菌液PCR及双酶切鉴定该载体后,用冻融法将其导入农杆菌EHA105。结果表明,成功培养出含有抗逆相关基因MvNHX1启动子pMvNHX1∶GUS∶EHA105的菌落;成功构建出新的植物表达载体pMvNHX1∶GUS。     

蚯蚓MT基因植物表达载体的构建及烟草转化

为了提高植物对重金属的耐受力和富集能力,从而减少重金属对土壤的污染,本研究将克隆的赤子爱胜蚓(Eiseniafoetia)MT基因,装入植物表达载体pPZP111,构建了植物表达载体pPZP-efMT。然后用三亲法将其导入根瘤农杆菌EHA105中,通过叶盘法转化烟草。经PCR检测,efMT基因已整合到烟草基因组中,为进一步验证转基因烟草的抗重金属能力奠定了基础。     

新型HMW-GS基因1Dy12.1~(*t)植物双元表达载体的构建及其遗传转化

为了建立快速研究高分子量谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit,HMW-GS)基因功能活性的植物表达体系,以自主克隆的新型HMW-GS基因1Dy12.1~(*t)为目的基因,利用限制性内切酶Xho Ⅰ和Sal Ⅰ切割后5'端能形成相同粘性末端的特性,成功构建了1Dy12.1~(*t)的植物双元表达载体pBINHP-GluT.该载体选择使用胚乳特异性强启动子,利用已知HMW-GS基因内部均不含有的Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ内切酶位点引入1Dy12.1~(*t)编码区,并将1Dy12.1~(*t)的表达调控置于T-DNA区内,从而奠定了其在不同HMW-GS基因功能活性研究上的便利性.通过根癌农杆菌烟草叶盘转化研究目的基因1Dy12.1~(*t)在植物体的表达特性,SDS-PAGE和western blotting鉴定结果表明,1Dy12.1~(*t)在转基因烟草种子胚乳中得到高效表达,进一步证实了所克隆基因的正确性和所构建载体的有效性.     

烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

青麻epsps基因在酵母中表达

将青麻epsps基因构建到酵母胞内表达载体pPIC3.5K中,利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中,PCR技术筛选出阳性转化子,证明外源epsps基因已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,经诱导表达后SDS-PAGE分析获知外源基因在酵母中获得了表达。并且通过草甘膦压力筛选出耐性较好的重组酵母菌株,证明所获得的epsps基因具有生物学功能。     

保卫细胞中特异表达启动子片段缺失后表达载体的构建

iMyAP基因启动子的核心启动子370 bp片段能启动基因在保卫细胞中特异性表达。将其进行缺失,克隆得到370 bp、308bp和150 bp的启动子片段,与pMD18-T载体连接并进行序列分析后用BLAST软件作同源分析的结果显示,它们的核苷酸序列与GenBank中登陆的iMyAP启动子片段的核苷酸序列一致。将这3个启动子片段分别与pCAMBIA-1303质粒相连,构建得到表达载体。     

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu表达载体构建及遗传转化

为了进一步优化黄瓜遗传转化体系,提高遗传转化效率,构建含有自身启动子的黄瓜果瘤基因(Tu)表达载体pCAMBIA2301-Tu,将表达载体通过电击法导入农杆菌菌株GV3101中,进行农杆菌介导的黄瓜遗传转化的研究。使用限制性内切酶KpnI和BamHI对质粒pCAMBIA2301和Tu基因PCR产物进行双酶切,回收目的片段,连接后成功构建Tu基因表达载体。通过优化遗传转化的生根条件以及抑制农杆菌生长条件,一定程度上提高了遗传转化的效率。580个外植体通过抗生素筛选获得的18株再生苗进行PCR检测和测序鉴定,最终获得8株阳性转化苗,转化效率为1.37%。     

白藜芦醇合酶基因表达载体构建及对马铃薯的遗传转化

利用从葡萄中克隆到的白藜芦醇合酶基因(Resveratrol Synthase,简称RS)构建了含有35S组成型启动子的植物表达载体P35s-2300-RS,应用农杆菌介导方法对马铃薯品种进行遗传转化.通过对抗性芽、生根、再生植株的筛选,得到5株再生小苗.经PCR、Southern检测证实,有3株为真正的转基因植株.     

拟南芥抑芽基因SPS的克隆及植物表达载体的构建

通过PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆了SPS基因,序列分析表明,与Genebank公布的序列完全一致。然后,将该基因亚克隆到植物表达载体pBI121上,并将载体pBI121上的CaMV35S启动子替换为烟草伤诱导启动子POD,构建成植物表达载体pBISPSPOD。     

八氢番茄红素脱氢酶基因超表达载体的构建及表达鉴定

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄中该酶的编码基因序列设计一对特异引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1 900 bp的全长cDNA片段。对这个全长片段构建了超表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体。采用农杆菌介导的方法转化番茄获得10株转基因植株,PCR检测表明外源基因已导入番茄基因组中。转基因番茄果实的番茄红素含量分析结果表明,转基因后代株系番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍,PDS编码基因的超表达有效促进了番茄果实中番茄红素的合成和积累。     

FaDREB1基因RNAi的植物表达载体的构建

以pMD18-T-FaDREB1为基础,构建了由35s启动子调控的FaDREB1基因RNAi的植物表达载体pART27-FaDREB1(1)-FaDREB1(2),并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LB4404中。对于研究RNAi的机理和应用以及研究DREB类转录因子基因的功能和应用具有重要的理论价值。