柑橘溃疡病菌PCR快速检测技术研究初报

应用柑橘溃疡病菌独有的保守基因设计并合成了引物对,建立柑橘溃疡病菌PCR检测技术.PCR检测结果表明,来源于不同产地的病菌菌株均可扩增出靶标带,而水稻白叶枯病菌不能扩增出靶标带;2×10~2×105 个·ml-1的溃疡病病菌悬浮液也均可扩增出靶标带,说明该PCR技术具有很强的特异性和检测灵敏度.研究结果也表明,来源于福建、四川和安徽的柑橘溃疡病菌具有同源性.     

超量表达CsGH3.6通过抑制生长素信号转导 增强柑橘溃疡病抗性

背景 由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）引起的柑橘溃疡病是柑橘生产上最具毁灭性的一种病害。植物生长素在调控柑橘溃疡病菌引起的寄主侵染部位脓疱形成中起重要作用。生长素早期响应基因GH3通过酰基化吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）调控植物激素动态平衡。前期研究发现柑橘CsGH3.6在调控生长素响应溃疡病侵染中起着重要作用。目的 通过对超量表达CsGH3.6转基因晚锦橙的抗病性、植株表型、细胞和激素变化进行分析,利用RNA-Seq解析CsGH3.6调控的信号通路,探明CsGH3.6调控激素动态平衡影响柑橘溃疡病抗性的内在机制。方法 利用针刺法对离体转基因叶片接种溃疡病菌Xcc,统计接种第10 天时病斑面积和病情指数,以野生型为对照,评价转基因植株的抗性水平;提取感病前后叶片内源激素,利用高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography,HPLC )检测转基因植株中激素含量变化;温室中观察转基因植株表型变化;通过测量叶片纵径、横径和厚度分析转基因植株叶型变化特征;制备叶片表皮切片,显微观察表皮细胞和气孔,并统计转基因植株表皮细胞长度和气孔密度;采用RNA-Seq测序技术研究转基因植株转录组变化情况,并利用Nr、Nt、Pfam、COG、SwissProt和gene ontology (GO)数据库注释基因功能,进一步利用KEEG数据库和MapMan软件解析超量表达CsGH3.6影响的重要基因、功能和途径,阐明CsGH3.6调控柑橘溃疡病抗性的分子机制。结果 超量表达CsGH3.6显著增强转基因植株的溃疡病抗性;转基因植株分枝增多且下垂,叶片向上卷曲,变小,颜色浅;转基因植株气孔密度增加,表皮细胞变短;激素含量分析显示,转基因植株自由生长素（IAA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）含量显著降低,而水杨酸（salicylic acid,SA）含量显著增加;转录组测序分析表明,超量表达CsGH3.6显著抑制生长素信号转导相关基因表达,特别是所有注释的Aux/IAA家族基因均下调表达,相反,与生物胁迫相关基因的表达为上调,其中绝大部分基因为病程相关蛋白基因。结论 超量表达CsGH3.6通过酰基化自由IAA抑制生长素信号转导,调控JA和SA的动态平衡,改变细胞和植株的形态建成,从而增强柑橘对溃疡病的抗性。研究结果暗示调控激素动态平衡在柑橘抗病育种中具有潜在价值。     

广西柑橘黄龙病发生情况及黄龙病菌的遗传多样性分析

【目的】了解广西柑橘主产区黄龙病（Huanglongbing,HLB）危害情况及黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas）的遗传多样性,为黄龙病的田间诊断和科学防控提供参考。【方法】对广西柑橘主产区8个地级市有代表性的柑橘园进行2个年度（2020和2021年）的跟踪调查并随机采集1048份柑橘叶片样品,利用qPCR技术对采集的样品进行CLas检测,并对阳性样品CLas菌株的基因组高变区的扩增产物进行测序,分析CLas菌株的遗传多样性。【结果】与2020年相比,除采自百色的柑橘样品CLas检出率2个年度保持不变（14.29%）外,2021年采自玉林、桂林、河池、梧州、南宁、贺州和来宾的柑橘样品CLas检出率均呈上升趋势,其中2021年采自梧州的柑橘样品CLas检出率最高（52.94%）。不同种类柑橘的CLas检出率差异明显,2021年甜橙类、柚类、杂交柑类和金柑类的样品CLas检出率均较2020年升高,2个年度的宽皮柑橘类CLas检出率相同（14.29%）。不同症状类型的柑橘样品CLas检出率也存在较大差异,其中2021年采集的缺素黄化型样...     

转录因子CsWRKY61对柑橘溃疡病抗性的影响

【背景】柑橘溃疡病(citrus bacterial canker,CBC)是世界柑橘产业上危害最严重的病害之一,由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起,在国内外被列为检疫对象。由于柑橘分子病理研究相对滞后,导致可供利用的抗性基因资源相对匮乏。WRKY转录因子参与植物抵御生物和非生物胁迫反应,前期研究发现柑橘WRKY转录因子可能在调控寄主抗病反应中起着重要作用。【目的】通过对超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72转基因晚锦橙(Citrus sinensis)的溃疡病抗性进行评价,明确这些基因在柑橘响应溃疡病菌侵染中的生物学功能和抗病育种价值。进一步利用RNA-Seq解析CsWRKY61调控的信号通路。【方法】利用农杆菌介导法进行柑橘遗传转化,获得超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72的晚锦橙;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析转基因植株中目的基因的表达水平以及拷贝数;以非转基因植株为对照,采用离体针刺接种评价转基因植株对溃疡病的抗性;通过比较超量表达CsWRKY61和野生...     

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和La...     

利用SSR和SRAP技术分析广西柑橘种质遗传多样性

利用SSR和SRAP 2种分子标记技术对11份广西野生柑橘种质、13份广西地方品种和10份对照品种,共计34份柑橘类材料进行遗传多样性分析,结果表明:选用22对SSR和11对SRAP引物组合进行PCR扩增,依次获得221和215条多态性条带,平均每对引物获得10.1和19.5条多态性条带;SSR聚类图显示34份柑橘种质两两之间的遗传相似系数为0.78~0.96,SRAP聚类显示遗传相似系数为0.60~0.92;2种分子标记基本上能有效地区分宽皮柑橘类、枸橼类、柚类、大翼橙类、宜昌橙类和马蜂柑;同时,广西地区宽皮柑橘类与道县野橘、皱皮柑类与元橘、印度野橘与枸橼类的尤力克柠檬、大种橙与大翼橙类和阳朔金柑、柚类与大翼橙类亲缘关系紧密。     

湖南柑橘溃疡病菌的多态性鉴定及致病力分析

采集湖南省6个柑橘产区的呈现典型溃疡病症状的柑橘叶片、枝条或果实样品26份,分离溃疡病菌株,采用柑橘溃疡病特异性引物鉴定、细菌保守的16S rDNA序列分析及重复序列PCR基因指纹分析(Rep–PCR)方法,分析具有地域代表性的12个菌株间基因组多态性。结果显示,12个菌株在BOX–PCR和ERIC–PCR中扩增出相同数量的多态性条带,无法通过Rep–PCR对菌株进行区分;串联重复位点多态性分析表明,CCB–2、CCB–3和CCB–10这3个菌株在GT1位点上出现片段大小多态性;通过活体注射接种方式,将12个溃疡病菌株接种至冰糖橙叶片,结果 CCB–2和CCB–4菌株表现出较稳定致病力,综合病情指数达到75%以上,表明CCB–2相比其他11个菌株可能在基因组序列水平存在多态性,且影响菌株的致病力水平。     

钙对枳生长发育及柑橘溃疡病抗性的影响

【背景】柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的细菌性病害,可侵染枝、叶、果,危害几乎所有的柑橘主栽品种。前期对湖南省39个柑橘园的调查结果显示柑橘果园土壤酸化和交换性钙缺乏严重,叶片中均存在钙缺乏现象。钙是植物所需大量元素之一,钙缺乏会造成植物营养失衡,生长势下降,植物免疫水平受影响。然而,钙元素对柑橘溃疡病抗性的影响尚不明确。【目的】分析对柑橘溃疡病敏感的枳(Poncirus trifoliata)在不同钙浓度处理下叶片注射接种Xcc后的致病差异,探讨钙在Xcc侵染枳叶片过程中的作用。【方法】采用沙培法对枳实生苗进行0、0.75、3、30 mmol·L^-1钙浓度处理,分别测定枳生长期的生物量、叶绿素a和b浓度、根系和叶片钙元素含量、观察根系活性氧(ROS)的产生和胼胝质沉积,并分析枳叶片接种Xcc后细胞壁合成相关基因及免疫途径相关基因诱导表达变化特征。【结果】以3 mmol·L^-1钙处理为对照,0、0.75和30 mmol·L^-1钙处理后,...     

柑橘溃疡病抗性相关转录因子CitMYB20的功能

【目的】了解柑橘不同品种CitMYB20对柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)和外源植物激素的应答情况,评价转基因植株对柑橘溃疡病的抗性,验证CitMYB20的生物学功能。【方法】根据柑橘基因组序列设计引物,PCR法同源克隆柑橘溃疡病抗性品种金弹金柑(Fortunella japonica)和敏感品种枣阳小叶枳(Poncirus trifoliata)的CitMYB20基因序列和启动子序列,利用在线软件PlantCARE对启动子序列进行顺式作用元件预测。以针刺法对金弹金柑和枣阳小叶枳离体叶片接种柑橘溃疡病菌,用外源激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理金弹金柑和枣阳小叶枳的叶片,在处理的不同时期收集材料,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CitMYB20的表达水平。分别构建CitMYB20的过表达载体和抑制表达载体,根癌农杆菌法转化枳上胚轴,随机摘取转基因株系成熟叶片进行柑橘溃疡病离体抗性评价。【结果】金弹金柑和枣阳小叶枳中CitMYB20(GenBank登录号分别为MN689609和MN689608)序列高度保守,相似度达到99%...     

杀菌剂对柑橘溃疡病菌的毒力测定

为了筛选对柑橘溃疡病菌有强烈抑制作用的化学药剂,通过室内平皿菌落计数法,检测了70%氢氧化铜可湿性粉剂、20%噻菌铜悬浮剂、3%中生菌素可湿性粉剂、77%多宁可湿性粉剂和72%农用硫酸链霉素5种杀菌剂对柑橘溃疡病菌的抑制作用。毒力测定表明:70%氢氧化铜可湿性粉剂、20%噻菌铜悬浮剂、3%中生菌素可湿性粉剂、77%多宁可湿性粉剂和72%农用硫酸链霉素对柑橘溃疡病菌的EC50值分别为265.71、93.86、162.89、127.61、38.62μg/mL。根据EC50值分析,72%农用硫酸链霉素对柑橘溃疡病菌的室内抑制作用最强,20%噻菌铜悬浮剂次之,70%氢氧化铜可湿性粉剂的效果最差,其抑制作用为72%农用硫酸链霉素>20%噻菌铜悬浮剂>77%多宁可湿性粉剂>3%中生菌素可湿性粉剂>70%氢氧化铜可湿性粉剂。     

麻风树无性系种实性状变异与选择

【目的】分析麻风树单果均质量、百粒质量、出仁率、出籽率、种子体积、种仁含油量和单株果实产量等性状的遗传变异,在此基础上,对无性系进行评选.【方法】对海口市新海林场3年生麻风树无性系试验林33个无性系的种实特征进行调查;通过聚类分析,对参试无性系进行分类,并作综合评定.【结果和结论】麻风树无性系间在种实性状上存在显著差异.18号无性系百粒质量最大,26号和20号种仁含油量最高;百粒质量与单果均质量、种子体积和种仁含油量相关性达到极显著水平,种仁含油量除与出籽率和种子体积相关性不显著外,与其他性状相关性均达到显著水平;经综合评价,初步确定1、30、18、15和25号为优良无性系.     

野油菜黄单胞菌中长链3-酮脂酰ACP合成酶的鉴定

【目的】研究野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris 8004基因组中3个标注为3-酮脂酰ACP合成酶的基因Xcfab F1、Xcfab F2和Xcfab B在脂肪酸合成过程中的功能.【方法】将这3个基因分别克隆到表达载体p BAD24M,然后转化大肠埃希菌Escherichia coli的fab B和fab F温敏型突变株CY242和CY244,同时利用体外无细胞抽提物酶学分析Fab F1、Fab F2和Fab B蛋白活性.【结果和结论】Xcfab F1和Xcfab B基因分别能遗传互补大肠埃希菌fab F和fab B突变,而Xcfab F2基因则不能互补大肠埃希菌fab F或fab B突变.体外无细胞抽提物酶学分析表明Fab F1和Fab B都能完成辛脂酰-ACP的延伸,但Fab F2则不能完成该酶促反应.Xcfab B基因编码3-酮脂酰ACP合成酶I,Xcfab F1基因编码3-酮脂酰ACP合成酶II,而fab F2基因不参与中长链脂肪酸的合成.     

小果油茶种实表型性状遗传多样性研究

分析了小果油茶全分布区的18个地理群体进行种实表型性状遗传多样性。结果表明,小果油茶种实表型性状变异相当丰富,小果油茶18个群体10个种实表型性状的平均变异系数高达24.7%,平均相对极差也达到48.2%,种实表型性状在群体间及内差异极显著。巢式方差分析结果表明:总体上小果油茶群体间多样性程度略大于群体内的多样性,其中性状Tf、Ls/Ws、Lf、Wss及Ls在群体间变异明显大于群体内的变异,Wf和Rs在群体间与群体内变异大小相当,群体间略大于群体内,而Ns和Lf/Wf则是群体内变异明显大于群体间变异,主要以群体内变异为主。种实聚类分析结果表明,小果油茶呈现较明显的地理区域特征,在欧氏平均距离4.22的阀值处可将划分为3个大类。相关性分析得知小果油茶表观性状没有随经纬度变化而呈现出较明显的地带性演变规律,但通过进一步的地理趋势面分析得知,Rs、Ls/Ws及Ws与经纬度的拟合度及拟合效果均达到较好的水平,呈现出较明显的地带性分布规律。     

柑橘木虱趋光行为及复眼结构分析

【目的】研究柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama对不同光波的趋光性,探索其复眼结构及在光适应和暗适应下的结构变化并阐明其趋光机制,为发展柑橘木虱非化学防控技术奠定基础。【方法】选用趋光反应装置测定柑橘木虱成虫对不同光波的趋光率,利用扫描电镜技术和组织切片方法对成虫复眼形态和结构进行观察。【结果】柑橘木虱成虫对不同波长光的趋光率不同,对紫外光(365～370 nm)的趋光率为66.62%～71.38%,蓝光(470～475 nm)为47.17%～50.88%,绿光(520～525 nm)为39.37%～44.26%,黄光(590～592 nm)为28.18%～31.32%,红光(620～630 nm)为14.68%～18.33%。成虫复眼呈半球形,位于头部两侧触角基部,表面光滑无辅助结构,属于典型的并列相眼。小眼由角膜、晶锥、视网膜细胞、基膜和色素细胞组成,位于复眼中心区域的小眼呈六边形,边缘区域的小眼呈近圆形。雌、雄成虫每个复眼的小眼数分别为225～254和238～252个。【结论】柑橘木虱成虫对紫外光、蓝光和绿光的趋光率显著高于白光,雌雄成虫在复眼结构和形态方面没有明显的差异。研究结果为阐明柑橘木虱趋光行为的机制提供了理论基础。     

马链球菌马亚种新疆株SeM基因的克隆及序列差异分析

为研究马链球菌马亚种新疆株SeM基因的分子特征,分析新疆地区马链球菌马亚种的分子流行特征以及为马腺疫的防治提供依据,对分离并鉴定的5株马链球菌马亚种提取基因组、扩增并克隆其SeM基因(GenBank登录号分别为:KJ486792、KJ486793、KJ486794、KJ486795、KJ486796),采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行疏水性、抗原性及三级结构分析,并与Genbank登录菌株的SeM基因序列进行系统进化分析和比较。克隆获得的SeM基因长度为1 530bp,包含1个1 527bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸;新疆分离株SeM基因与Genbank登录分离株SeM基因同源性为98.0%~99.4%。结果表明,新疆分离株KJ486793、KJ486796与美国分离株亲缘关系较近,属同一个进化分支,另外3株新疆分离株KJ486792、KJ486795、KJ486794构成一个独立分支。     

滴灌施用噻虫胺防治柑橘木虱研究

【目的】明确滴灌施药防治柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama的可行性,为田间控制柑橘黄龙病传播提供新的手段。【方法】通过室内模拟滴灌施用噻虫胺,测定了噻虫胺在土壤中的分布以及柑橘叶片中含量,研究了滴灌施药对柑橘木虱防治效果。通过田间试验,检测分析了柑橘叶片中噻虫胺含量。【结果】在室内条件下,一次滴灌施药对柑橘木虱的防治效果可长达4个月;噻虫胺在土壤中以滴头为起始点在土壤中呈半圆形迁移分布,当柑橘叶片中噻虫胺质量分数大于0.64 mg·kg–1时,对柑橘木虱的防治效果均高于80%。田间试验表明,在药后7～63 d柑橘上部叶片中噻虫胺的质量分数大于0.64 mg·kg–1。【结论】滴灌施用噻虫胺能有效防治柑橘木虱,是田间控制柑橘黄龙病传播的有效手段。     

水稻白叶枯病菌III型效应物基因hpaF与毒力相关

【目的】稻黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv. oryzae （Xoo）PXO99^A菌株中PXO_03420基因被注释为编码具有多个LRR的III型效应物基因hpaF,本研究旨在明确hpaF基因的功能,为完善Xoo III型效应物的研究提供一定的理论基础.【方法】通过同源双交换构建hpaF基因的缺失突变体,并通过表型分析、致病性试验和遗传互补对该基因的功能进行研究.【结果和结论】本研究发现,hpaF基因突变后对水稻日本晴品种的致病力降低了51.81%,减弱了细菌在非寄主植物蓖麻上的过敏反应.而带有hpaF全基因片段的pLAFR3能够恢复hpaF突变体的致病表型,结果表明hpaF基因与水稻白叶枯病菌的致病性相关.     

马腺疫链球菌新疆株2种新SeM基因型的鉴定及其遗传变异分析

为了解马腺疫链球菌新疆流行株的基因型、菌株的遗传多样性和系统发育特征,采集新疆地区某马场患病马匹下颌组织病样,分离马腺疫链球菌（Z422、JMC111）,并对分离菌株进行生化特性和耐药特性检测,然后进行16S rRNA基因序列比较和SeM基因分子分型。结果显示,2株分离菌均为马链球菌马亚种,对头孢噻呋、头孢西丁、左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、磺胺异恶唑敏感,对青霉素、头孢呋辛、氨苄西林、克拉霉素耐药。基于16S rRNA基因序列的分析显示2株菌均归属于 Ⅰ 群,基因分型鉴定为新的SeM基因型：seM 208和seM 209。     

基于ISSR分析湖北省枫香资源的遗传多样性

为了给湖北省枫香资源的保护与利用提供科学依据,选取湖北省远安（YA）、红安（HA）、赤壁（CB）、竹溪（ZX）、南漳（NZ）、利川（LC）和武汉（WH）的枫香资源为研究对象,并以安徽黄山（HS）、重庆丰都（FD）、江西铜鼓（TG）和海南霸王岭（BWL）的枫香资源为对照,采用ISSR分子标记对这11个枫香群体的335份个体样品进行了遗传多样性分析。结果表明：（1）湖北省7个枫香群体的215份样本共扩增得到334个条带,其中多态性条带306条。群体内的遗传变异为84.19%,群体间遗传变异为15.81%,基因流（N_m）为2.663 3。在群体内部,HA和WH的遗传多样性最丰富,ZX的遗传多样性最低。ZX和LC的亲缘关系最近,YA和LC的亲缘关系最远。当遗传相似系数为0.94时,可将7个群体分为4个大类,NZ、LC和ZX群体聚为一类,YA和WH群体聚为一类,HA群体、CB群体分别单独聚为一类。 （2）11个枫香群体共扩增出349个条带,其中多态性条带320个,平均多态性百分比为91.69%。不同群体的多态位点百分率范围为54.29% ~ 77.14%,平均值为67.01%。WH和HA的遗传多样性最丰富,BWL的遗传多样性最低。11个群体中,18.01%的遗传变异存在于群体间,群体内的遗传变异为81.99%,基因流（N_m）为2.276 5。在群体内部,HA和WH的遗传多样性最丰富,BWL的遗传多样性最低。遗传相似度和遗传距离均显示,ZX和TG的亲缘关系最近,TG和BWL的亲缘关系最远。当遗传相似系数为0.93时,可将11个群体分为四大类：第1类包括NZ、ZX、TG和LC;第2类包括FD、HA和CB;第3类包括YA、WH和HS;第4类是BWL单独一类。 可见湖北省7个枫香群体的聚类结果与其自然地理分布大致吻合,可分为东部、中部和西部三大类;4个省外枫香群体中,除BWL单独聚成一类外,其余3个群体（TG、FD和HS）并未与湖北省内地理位置临近的群体聚为一类。