实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究

以转基因大豆Roundup Ready为材料，通过特异性引物和探针，对转基因大豆中外源基因cp4-epsps进行了定量检测。研究发现Taqman荧光探针法和SYBR荧光染料法均可作为转基因大豆定量检测的方法，但前者比后者具更高的检测灵敏度和精确度，其检测阈值可降到0.05%，变异系数为0.09%~0.53%。在此基础上，建立和优化了Taqman探针实时荧光定量PCR检测技术体系，有助于提高转基因作物及产品的生物安全性定量检测的准确度和可靠性。     

五类马铃薯病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为提高马铃薯病毒检测效率和检测通量,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测技术对马铃薯苗中X病毒、Y病毒、S病毒、卷叶病毒及纺锤状块茎类病毒进行检测,以期构建五种马铃薯病毒的检测方法。结果表明,qRT-PCR法阳性检测率为6%,灵敏度比DAS-ELISA法高。qRT-PCR检测方法特异性强,重复性好,灵敏度高,可有效检测马铃薯的五种病毒。     

镰孢菌属实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。     

转基因耐除草剂大豆ZH10-6实时荧光定量PCR检测方法的建立

转基因耐除草剂大豆ZH10-6是含有G2-EPSPS基因和GAT基因耐除草剂大豆新品系,对广谱型除草剂草甘膦具有耐受性,在中国具有重要产业化应用前景.本研究以其转化体特异性序列为靶标,建立了基于Taqman水解探针的实时荧光定量PCR检测方法.该方法能特异、定量检测出转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体成分,线性度大于...     

实时定量PCR检测技术研究进展

传统定量PCR检测方法如内参照法和竞争PCR法,因为在达到平台期后才能对其进行检测,由于PCR扩增已经过了对数期,其检测重复性相对较差.而实时荧光定量PCR技术可直接监测PCR过程中荧光信号的变化,以获得目的区段扩增产物定量的结果,直接可以进行定性分析和定量分析,操作简便无污染.本文通过对实时荧光定量PCR检测技术的原理、分类、方法和应用4个方面阐述实时定量PCR检测技术研究进展.     

梨小食心虫实时荧光PCR检测技术的建立与验证

梨小食心虫（Grapholitha molesta）为我国常见蛀果性害虫,与其他梨果害虫的组织形态非常相似,仅凭形态学特征难以区分,需建立实时荧光PCR检测方法在基因水平上进行鉴定。通过样品核酸提取与质控,设计并验证荧光探针特异性,进一步通过优化反应条件和反应体系,结合特异性分析、灵敏性比对和盲样测试开发了梨小食心虫实时荧光定量PCR检测方法。结果表明：方法特异性强,重复性好（重复间变异系数为0.055~0.359）,可靠性高（标准曲线中的R2值为0.991）,检出限低（最低检出限3 pg/μL）,盲样测试结果与形态学鉴定结果一致,能满足日常检验检疫需求。该操作方法简单易行,检测时限短（约3 h）,通量高,特别适合于大批量的抽样检查,可应用于梨小食心虫的检疫工作。     

肉毒梭菌的荧光定量PCR检测方法

根据肉毒梭菌神经毒素基因设计的引物和探针,建立了肉毒梭菌荧光定量PCR快速检测方法。肉毒梭菌产生了典型的"S"型曲线,其他干扰菌都无扩增,说明引物特异性较好,检测灵敏度为1×103 cfu/mL。该方法能够实现肉毒梭菌的快速检测,具有灵敏度高、特异性好的特点。     

不同地区辣椒疫霉菌生理小种的鉴定和生物学特性的研究

为了确定不同地区采集的辣椒疫病病原菌的菌种类型及其生理小种类型,首先利用形态学和分子生物学的手段对广东、山西和内蒙古等地的辣椒疫病的病原菌进行了鉴定,结果表明,所分离到的7株病原菌均为辣椒疫霉菌。通过比较不同地区分离到的疫霉菌生物学特性,发现不同地区辣椒疫霉菌在菌落形态、孢子囊的数量、生长速度等方面存在显著的差异。利用国际通用的鉴别寄主,对分离到的7个辣椒疫霉菌进行生理小种的鉴定,结果表明,来源于广东的辣椒疫霉菌P1是2号生理小种,而来源于山西和内蒙古的6株辣椒疫霉菌P2~P7都是3号生理小种。目前,在山西和内蒙古地区并没有关于辣椒疫霉菌生理小种鉴定的任何报道,确定了这2个地区的辣椒疫霉菌的优势生理小种为3号生理小种。     

以实时荧光定量PCR技术检测转基因玉米MON88017

根据转基因玉米MON88017的左侧侧翼序列和玉米内标基因(zSSIIb)分别设计特异性引物及Taqman探针,通过实时荧光PCR技术建立MON88017的定量特异性检测方法。利用含有内标基因和侧翼序列的标准质粒分子,建立了玉米内标基因和侧翼序列的标准曲线。检测了5个已知MON88017含量(0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%)的混合样品中的转基因含量,结果表明检测底限可以达到19~30个阳性拷贝。该研究建立的实时荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强。     

辣椒疫霉菌菌种保存及致病性研究

在辣椒疫病抗性材料鉴定和疫霉菌生理小种测定等工作中, 常因菌种在室内连续多代转接培养导致菌株的致病力下降, 影响测定结果的准确性和一致性。针对辣椒疫霉菌的长时间保存这一问题, 通过对 4个辣椒疫霉菌株的长时间无菌水保存和常规固体培养基斜面连续转接保存方法进行试验对比,定期对菌株培养性状和致病力进行观察和测定。试验结果表明： 在 16℃条件下, 无菌水中保存的辣椒疫霉菌株在 24个月后仍有活力, 菌株培养性状没有发生变化, 致病性也没有明显衰退。该菌种保存方法制作简单、 经济、 可靠, 适用于辣椒疫霉菌种的长期保存。     

不同辣椒材料对疫病的抗性研究

为筛选抗性种质资源,进行抗性品种选育和推广种植,利用苗期游动孢子灌根法对206份江西省地方辣椒材料进行抗病性鉴定,并初步分析不同时期材料的发病情况。研究结果表明,不同材料间的抗病性存在较为明显的差异,无论是病株率还是病情指数均有显著差异性,病株率在0～30.0%、30.1%～70.0%、70.1%～100%之间的材料分别为21、32、153份,占供试材料的10.19%、15.53%、74.27%;表现为高抗、抗病、中抗和感病的材料分别有15、17、23、151份,占供试材料的7.28%、8.25%、11.17%和73.30%;鉴定出的‘赣椒18号’‘、赣椒35号’、C047、WY38、CM334和A204等15份高抗材料是很好的抗疫病资源。分析供试材料在2次调查结果中的发病情况可知,材料间的发病速度(侵入和扩展)存在显著差异性。     

辣椒疫病生防菌株鉴定及控病机理研究

为筛选出对辣椒疫病菌具有较强抑制活性的生防菌株,达到控制辣椒疫病的目的,从辣椒种植区土壤中分离大量微生物,采用平板对峙法筛选对辣椒疫病菌具有较强抑制作用的生防菌株XD6,通过常规方法和16SrDNA确定其分类地位,并测定相关酶活性变化。试验分离得到的XD6菌株,平板对峙试验防治效果高达80%~100%,初步鉴定为多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。酶活测定显示,生防菌株XD6的β-1,3-葡聚糖酶和纤维素酶活性都存在显著变化,且接种XD6菌株的辣椒植株PAL活性、PPO活性、POD活性均明显升高。菌株XD6对辣椒疫病具有较高防效,其生防因子可作用于辣椒疫病菌细胞壁,并诱导辣椒自身防御酶系的增强,具有良好的研究前景。     

利用不同实时定量PCR方法分析相对基因表达差异

利用实时荧光定量PCR方法分析目标基因转录本之间的表达差异,目前常用的分析实验数据的有绝对定量和相对定量方法。为了克服绝对定量方法的繁琐和简化相对定量的分析方法,分别利用2^-ΔΔCT、2^-ΔCT和标准曲线法对水稻OsRDB1基因在不同化学试剂和激素处理下的表达差异进行了分析,发现2^-ΔΔCT必须引入标准的看家基因作为参考,计算方法繁琐,计算结果受扩增效率影响;而利用2^-ΔCT和标准曲线法计算方便,节省定量PCR试剂,但其结果易受到RNA浓度测量准确率的影响,其中标准曲线法引入斜率消除扩增效率的影响,最能测得实际的原始拷贝数差异。     

辣椒疫霉不同发育阶段对氟吗啉的敏感性研究

从江西省各地采集分离获得108个辣椒疫霉菌株,通过菌丝生长法等测定了辣椒疫霉菌的不同生长阶段对氟吗啉的敏感性。研究结果表明,氟吗啉对辣椒疫霉菌的不同生长发育阶段的抑制作用明显,辣椒疫霉菌丝生长对氟吗啉的敏感性较高,EC₅₀值范围为0.07852~0.38622 μg/mL,平均EC₅₀值为0.18159 μg/mL;游动孢子囊形成对氟吗啉的敏感性更高,EC₅₀值范围为0.00251~0.03943 μg/mL,平均EC₅₀值为0.01588 μg/mL;游动孢子萌发对氟吗啉的敏感性最高,EC₅₀值范围为0.00156~0.00965 μg/mL,平均EC₅₀值为0.00515 μg/mL。正态分析表明,辣椒疫霉菌108个菌株的3个发育阶段对氟吗啉的敏感性符合正态分布,江西省内目前还不存在耐药性的辣椒疫霉群体。     

Inheritance of adult-plant resistance to Phytophthora capsici in pepper

Summary Inheritance studies were conducted to determine the genetic basis of adult-plant resistance in pepper (Capsicum annuum L.) to Phytophthora capsici. F₁, backcrosses and F₂ populations were developed using the resistant parent Criollo de Morellos 334 and susceptible parents Agronômico 10-G and Yolo Wonder. Pepper plants, at 36 days post-emergence, were inoculated near the base of the stem with an inoculum suspension of 5×10⁴ zoospores/ml. Segregation ratios in the F₂ generation of 13 resistant to 3 susceptible plants fit a 2-gene model for resistance with dominant and recessive epistasis.     

烯酰吗啉与百菌清复配对辣椒疫霉菌的增效作用

通过离体试验测定烯酰吗啉与百菌清复配对辣椒疫霉菌不同生长发育阶段的毒力发现,在烯酰吗啉与百菌清11个不同复配组合中,最佳配比为1∶11,其对抑制辣椒疫霉菌孢子囊形成、游动孢子萌发和菌丝生长的增效系数分别为1.54,2.37,1.86,均表现为增效作用;以1∶9和11∶1复配时,分别对抑制游动孢子萌发和菌丝生长也表现为增效作用,增效系数分别为1.59,1.50;采用小株喷雾法测定了烯酰吗啉与百菌清的两种复配组合对辣椒疫病的预防效果和持效期。复配比例为11∶1时,10,5,1mg/L3个浓度处理对辣椒疫病的预防效果均显著高于相同浓度单剂处理,并且在用药后第14天时,10mg/L相对防效依旧高达67.50%,用药间隔期可达14d;复配比例为1∶11时,10mg/L处理对辣椒疫病的预防效果显著高于烯酰吗啉相同浓度处理,持效期也延长2～3d;与百菌清相同浓度相比,其预防效果也相对较高。     

辣椒疫霉对双炔酰菌胺抗药性生理生化机制研究

本试验对辣椒疫霉亲本菌株和抗性菌株的生理生化指标进行了测定,初步研究了辣椒疫霉对双炔酰菌胺产生抗性的机制。结果表明:辣椒疫霉亲本菌株和抗性菌株的菌丝生长受NaC l和葡萄糖影响较小,且NaC l和葡萄糖不同浓度处理后的所有菌株之间渗透压也均不存在显著性差异,故得知NaC l和葡萄糖均不能为疫霉菌提供营养和抑制其渗透。双炔酰菌胺低浓度处理能够使抗性菌株菌体内渗漏出较多的内含物,但随着处理时间的延长和浓度的提高内含物渗漏反而减少;亲本菌株和抗性菌株菌体内可溶性蛋白含量和β-1,3葡-聚糖酶的活力差异显著:亲本菌株菌体内的可溶性蛋白含量和β-1,3葡-聚糖酶的活力均高于抗性菌株。随着双炔酰菌胺处理时间的延长,亲本菌株和抗性菌株的可溶性蛋白含量和β-1,3葡-聚糖酶的活力都呈下降趋势。由此得出:辣椒疫霉内含物通过细胞膜外渗,致使药液在菌体内的积累减少,最终使到达作用靶标药剂的实际浓度下降;同时菌体的可溶性蛋白含量降低、β-1,3葡-聚糖酶的活力下降可能是对双炔酰菌胺产生抗性的原因。     

文冠果实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选适用于文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)性别分化过程研究和不同器官的内参基因,本研究以文冠果性别分化关键期的顶芽和侧芽、根、茎、叶、种仁、雌能花和雄能花为材料,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)鉴定7个候选内参基因(Actin,UBQ,EF-1α,TUB,eIF-4α,18S rRNA和GAPDH)在各样品中的表达量,并评价7个基因的表达稳定性。结果表明,7个候选内参基因在不同样品中的表达量存在明显差异,各基因在雌能花中的表达均显著高于其他材料,在雄能花中的表达处于较低水平;适用于文冠果性别分化过程的最优内参基因为UBQ和eIF-4α,适用于不同器官的最优内参基因为EF-1α和GAPDH。研究结果将对今后进行文冠果性别分化过程研究和不同器官中的基因表达分析提供参考。